Se presenta un flujo de trabajo semi-automático para específica secuenciación de 16S rRNA de la leche humana y otros tipos de biomasa, bajo muestra.
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Artículo de método
Un método de secuenciación de 16S específica de las muestras de leche humana
En este artículo
Resumen
Resumen
Estudios de comunidades microbianas se han generalizado con el desarrollo de la secuencia relativamente barato, rápido y alto rendimiento. Sin embargo, al igual que con todas estas tecnologías, la reproducibilidad depende de un flujo de trabajo de laboratorio que incorpora controles y precauciones apropiadas. Esto es particularmente importante con las muestras de baja biomasa donde contaminantes ADN bacteriano pueden generar resultados engañosos. Este artículo detalla un flujo de trabajo semi automatizado para identificar microbios de las muestras de leche materna humana utilizando secuenciación específica de la región de V4 de ARN ribosómico (ARNr) 16S en una escala de bajo a medio throughput. El protocolo describe la preparación de las muestras de leche entera, incluyendo: lisis, extracción de ácidos nucleicos, la amplificación de la región V4 del gene del rRNA 16S y preparación de la biblioteca con las medidas de control de calidad de la muestra. Lo importante, el protocolo y la discusión consideran cuestiones que son salientes a la preparación y análisis de muestras de baja biomasa incluyendo controles positivos y negativos adecuados, eliminación de inhibidor de la polimerización en cadena, contaminación de las muestras ambiental, reactivo, o fuentes experimentales y experimentales mejores prácticas destinadas a garantizar la reproducibilidad. Mientras que el protocolo como se describe es específico para las muestras de leche humana, es adaptable a numerosos tipos de muestras de biomasa de baja y alta, incluyendo las muestras recogidas en torundas, congelados aseado o estabilizado en un buffer de conservación.
Introducción
Las comunidades microbianas que colonizan seres humanos se creen que son críticamente importantes para la salud y la enfermedad que influyen en el metabolismo, desarrollo inmune, susceptibilidad a la enfermedad y las respuestas a la vacunación y medicamentos terapia1, 2. esfuerzos para comprender la influencia de la microbiota en la salud humana en la actualidad destacan la identificación de los microbios asociados con compartimentos anatómicos definidos (es decir, piel, intestinal, oral, etc.), así como de sitios localizados dentro de Estos compartimentos3,
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Protocolo
Para todos los pasos de protocolo, debe llevarse equipo de protección personal apropiado (PPE) y estrategias de prevención de contaminación estrictas deben tomarse. Observar el flujo de trabajo de pre-amplificación áreas para las áreas de trabajo de la amplificación para minimizar la contaminación de las muestras de trabajo. Todos los materiales utilizados son estériles, libres de Rnasa, DNasa, ADN y pirógenos. Se filtran todas las puntas de pipeta. Un diagrama de flujo de los pasos del Protocolo se proporciona (figura 1).
1. lisis de la muestra
Nota: Lisis de la muestra y la extracció....
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Resultados
El protocolo que presentamos incluye pasos importante control de calidad (QC) para asegurar que la reunión de datos generados puntos de referencia para el control de sensibilidad, especificidad y la contaminación de protocolo. Primer paso de control de calidad del protocolo sigue la amplificación por PCR de la región 16S de V4 (figura 2). Un μl del producto de PCR de cada muestra se analizó por electroforesis para confirmar que estaba dentro del rango de tama.......
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Discusión
Objetivo generación secuenciación de 16S rRNA es una técnica ampliamente utilizada, rápida para microbioma caracterización18. Sin embargo, muchos factores, incluyendo efectos de lote, contaminación ambiental, contaminación de la muestra, sensibilidad y reproducibilidad pueden adversamente afectar resultados experimentales y confundir su interpretación7,19 , 20. para mejor facilitar el análisis de 16S robu.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Nos gustaría agradecer a Helty Adisetiyo, PhD y Shangxin Yang, PhD para el desarrollo del protocolo. Apoyo total para el internacional materno pediátrico adolescentes SIDA clínico ensayos grupo (IMPAACT) fue proporcionada por el Instituto Nacional de alergias y enfermedades infecciosas (NIAID) de los institutos nacionales de salud (NIH) números de premio UM1AI068632 (IMPAACT LOC), UM1AI068616 (IMPAACT SDMC) y UM1AI106716 (IMPAACT LC), con cofinanciación de Eunice Kennedy Shriver Instituto Nacional de salud infantil y desarrollo humano (NICHD) y el Instituto Nacional de Salud Mental (NIMH). El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no represen....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| AllPrep Mini kit de ARN/ADN | Qiagen | 80204 | Kit de extracción de ADN/ARN |
| Eliminasa | Fisher Scientific | 435532 | Descontaminante de ARNasa, DNasa, ADN |
| Thermo Mixer | Fisher Scientific | tampón de vórtice con control de temperatura | |
| RLT plus | Qiagen | 1053393 | tampón de lisis de tiocianato de guanidinio/ Parte del kit |
| Allprepß-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | 63689-25ML-F | ß-ME es un agente reductor que desnaturalizará irreversiblemente las RNasas al reducir los enlaces disulfuro |
| LME Beads | MP Biomedicals | 116914050 | tubo de bolas |
| QIAgen TissueLyzer | Qiagen | 85300 | de adaptadores disruptores de muestra automatizados |
| QIAshredder column | Qiagen | 79654 | |
| Tubo | tubo de microcentrífuga del fabricante en kit | ||
| QIAcube y artículos de plástico relacionados | Qiagen | 9001292 | instrumento automatizado de purificación de ADN/ARN |
| DNA exitus plus | Applichem | A7089 | solución de descontaminación no enzimática |
| EB Buffer | Qiagen | 19086 | tampón de elución |
| QIAgility y artículos de plástico | relacionadosQiagen | 9001532 | manipulador de líquidos robótico |
| PCR agua | MO BIO | 17000-5PRIME | |
| HotMasterMix | Quantabio | 2200400 | |
| Imprimadores inversos con código de barras | Eurofin | No Catálogo # Diseñado | y ordenado |
| Placa PCR de 96 pocillos | USA scientific | 1402-9708 | |
| Tapestation 2200 y artículos | de plástico relacionadosAgilent | G2964AA | analizador automatizado de fragmentos de ADN/ARN |
| Reactivos D1000 para Tapestation | Agilent | 5067-5585 | El tampón de muestra y la escalera forman parte de este kit |
| Kit de extracción de inhibidores de PCR OneStep Investigación | 50444470 Zymo Research | La eliminación del inhibidor de PCR se realiza según las instrucciones del fabricante. | |
| Kit de purificación de PCR QIAquick | Qiagen | 28104 | : purificación de productos de PCR basada en membrana de sílice |
| Qubit dsDNA HS Kit de dilución | Thermo Fisher | Q32854 | a base de dimetilsulfóxido forman parte de este kit. |
| Qubit Fluorómetro | Thermo Fisher | Q33216 | |
| NanoDrop | Espectrofotómetro de microvolumen | Thermo Fisher | |
| Kit MiSeq 300 V2 | Illumina | 15033624/15033626 | |
| MiSeq | Illumina | Sin catálogo # secuenciador de | próxima generación |
Referencias
- Ahern, P. P., Faith, J. J., Gordon, J. I. Mining the human gut microbiota for effector strains that shape the immune system. Immunity. 40 (6), 815-823 (2014).
- Postler, T. S., Ghosh, S. Understanding the Holobiont: How Microbial Metabolite....
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Reimpresiones y permisos
