Este protocolo permite al lector a analizar la formación de biopelículas inducida por sales biliares en patógenos entéricos usando un enfoque multifacético para capturar la naturaleza dinámica de los biofilms bacterianos mediante la evaluación de adherencia, formación de la matriz de sustancias poliméricas extracelulares, y de dispersión.
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Artículo de método
Formación de biopelículas inducida por sales biliares en patógenos entéricos: técnicas para la identificación y cuantificación
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Resumen
Resumen
Formación de biopelículas es un proceso dinámico y gradual que se produce en bacterias bajo condiciones ambientales difíciles o momentos de estrés. Para patógenos entéricos, se induce una respuesta de estrés importante durante el tránsito gastrointestinal y a la exposición de la bilis, un componente normal de la digestión humana. Para superar los efectos bactericidos de la bilis, muchos patógenos entéricos forman una biopelícula que se presumen para permitir sobrevivir al tránsito por el intestino. Aquí presentamos metodologías para definir la formación de biopelículas a través de ensayos de fase sólida adherencia así como detección de la matriz de sustancias poliméricas extracelulares (EPS) y visualización. Además, se presenta evaluación de dispersión de biofilm para imitar el análisis de eventos desencadenar liberación de bacterias durante el proceso de infección. Tinción de cristal violeta se utiliza para detectar bacterias adherentes en un ensayo de adherencia de la placa de 96 pozos de alto rendimiento. Evaluación de producción de EPS está determinada por dos ensayos, a saber, microscopía de tinción de la matriz EPS y análisis semicuantitativo con una lectina de polisacárido conjugado fluorescente. Por último, dispersión de biofilm se mide a través de recuentos de colonias y chapado. Datos positivos de ensayos múltiples apoyan la caracterización de biopelículas y pueden ser utilizados para identificar la formación de biopelículas inducida por sales biliares en otras cepas bacterianas.
Introducción
Formación de biofilms es una estrategia importante de supervivencia bacteriana inducida durante duras condiciones ambientales. Exposición a compuestos bactericidas como antibióticos o cambios en los nutrientes o la disponibilidad de oxígeno induce un estado de estrés en las bacterias que pueden ser aliviadas a través de la formación de biopelículas. Una biopelícula se caracteriza por el accesorio de bacteria a una superficie o a otras bacterias y se acompaña de la secreción de la matriz de EPS conformada principalmente por polisacáridos1,2,3. Formación de biopelículas es un p....
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Protocolo
1. preparación de reactivos
- Medio de las sales biliares: para preparar el caldo de soja tríptica (TSB) que contiene las sales biliares 0,4% (peso/volumen), resuspender 200 mg de las sales biliares en 50 mL esterilizado TSB. Filtro de esterilización usando un filtro de 0,22 μm. Hacer medio fresco cada semana.
Notas: Las sales biliares utilizadas habitualmente es una mezcla de 1:1 de colato sódico y desoxicolato de sodio aislado de las vesículas ovinas y bovinas. Como demostrado anteriormente4, la presencia de glucosa se requiere para la formación del biofilm inducida por sales biliares. TSB agrega glucosa en relación con caldo de Lu....
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Resultados
En la figura 1, formación de biopelículas se induce en la mayor parte del crecimiento siguiente prueba seis patógenos entéricos en medios que contienen sales biliares. Un aumento significativo de bacterias adherentes después de la exposición de las sales biliares se observa en casi todas las cepas probadas. La excepción es enteroaggregative e. coli (CEEA); sin embargo, tenga en cuenta la observación inducida de los mutantes de laaaf
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Discusión
Análisis de la formación de biofilm es un reto debido a la naturaleza dinámica de biofilms y la variabilidad entre cepas, materiales, laboratorios y ensayos. Aquí, se presentan varias estrategias para determinar la formación de biopelículas en patógenos entéricos después de la exposición de las sales biliares con conocimiento experimental para promover la reproducibilidad. Hay consideraciones adicionales para asegurar la reproducibilidad. Ante todo, recomendamos realizar independiente por lo menos tres experimentos con t.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen ninguna revelación.
Agradecimientos
Agradecemos a Rachael B. Chanin y Alejandro Llanos-Chea para asistencia técnica. Agradecemos a Anthony T. Maurelli, Bryan P. Hurley, Alessio Fasano, Brett E. Swierczewski y Bobby Cherayil para las cepas utilizadas en este estudio. Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de alergias y K22AI104755 de subvención de enfermedades infecciosas (C.S.F.). El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representan necesariamente las opiniones oficiales de los institutos nacionales de salud.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Caldo de Soja Tríptico | Sigma-Aldrich | 22092-500G | |
| Violeta Cristal | Sigma | C6158-50 | |
| Concanavalin-A FITC | Sigma | C7642-10mg | |
| Glucosa | Sigma | G7021-1KG | |
| Sales Biliares Sigma | B8756-100G | ||
| LB Agar | Sigma | L7533-1KG | |
| Tubos de cultivo de 14 mL, 17 x 100 mm, plástico, estériles | Fisher | 14-959-11B | |
| Vectashield antidecoloración rígida con DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | |
| Formaldehído | Sigma-Aldrich | F1635-500 | |
| Gluteraldehído | Sigma-Aldrich | G6257 | |
| Placas de 96 pocillos de fondo plano (transparentes) | TPP | 92696 | |
| Placas de fondo plano de 96 pocillos (negro) | Greiner Bio-One | 655076 | |
| Placas de fondo plano de 24 pocillos (transparentes) | TPP | 92424 | |
| Cubreobjetos de vidrio de 12 mm, redondos | Fisher | 08-774-383 | |
| Lector de placas de 96 pocillos | Spectramax | ||
| placas fluorescentes | Biotek Synergy 2 | ||
| Confocal o fluorescente Microscopio | Nikon A1 microscopio | ||
| 37° C Incubadora de agitación | New Brunswick Scientific Excella E25 | ||
| 37° Incubadora de placas C | Thermolyne series 5000 |
Referencias
- Joo, H. -S. S., Otto, M. Molecular basis of in vivo biofilm formation by bacterial pathogens. Chem Biol. 19 (12), 1503-1513 (2012).
- O'Toole, G., Kaplan, H. B., Kolter, R. Biofilm Formation as Microbial Development. Annu Rev Microbiol. 54 (1), 49-79 (2000).
- Donlan, R....
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Reimpresiones y permisos
