Una citometría de flujo Simple basado en análisis para determinar In Vitro anticuerpo dependiente del realce del Virus del Dengue usando suero convaleciente Zika Virus

Summary

Se describe un protocolo simple y fácil para medir la mejora dependiente de anticuerpos de la infección por Zika virus suero convaleciente con partículas virales de Dengue virus reportero.

Abstract

Mejora dependiente de anticuerpos de la infección se ha demostrado para desempeñar un papel importante en la patogenia viral de Dengue. Los análisis tradicionales que miden la capacidad de los anticuerpos o del suero para mejorar la infección en líneas celulares han confiado en usar salida viral en los medios de comunicación seguido por ensayos de placa para cuantificar la infección. Más recientemente, estos ensayos han examinado la infección del Dengue virus (DENV) en las líneas celulares usando los anticuerpos de fluorescencia marcados. Ambos estos métodos tienen limitaciones que restringen el uso generalizado de estas técnicas. Aquí, describimos un análisis simple en vitro con Dengue virus reportero partículas virales (RVPs) que expresan la proteína verde fluorescente y las células K562 a examinar mejora dependiente de anticuerpos (ADE) de la infección por DENV usando el suero que se obtiene de macaco de la India macacos 16 semanas después de la infección con el virus Zika (ZIKV). Esta técnica es confiable, implica la mínima manipulación de las células, no implica el uso de virus competentes de replicación directo y puede realizarse en un formato de alto rendimiento para obtener una lectura cuantitativa mediante citometría de flujo. Además, este análisis pueden ser adaptado fácilmente para examinar mejora dependiente de anticuerpos (ADE) de otras infecciones de flavivirus como el virus de la fiebre amarilla (YFV), virus de la encefalitis equina (JEEV), virus del Nilo Occidental (VNO) etc. donde RVPs están disponibles. La facilidad de establecer el ensayo, análisis de los datos y la interpretación de los resultados hacen altamente susceptibles a más valores de laboratorio.

Introduction

Mejora dependiente de anticuerpos (ADE) de la infección es un proceso por el que las respuestas de anticuerpos cruz-reactivos parcialmente inducidas por un serotipo de virus mejora la absorción de otro serotipo del virus, llevando a mayor replicación viral y viremia. ADE ha sido ampliamente documentado en las infecciones del virus (DENV) Dengue donde predominan cuatro serotipos principales. En un subgrupo de pacientes, ADE se asocia con la fiebre hemorrágica de Dengue (FHD). Recientemente hemos demostrado que la infección del virus (ZIKV) Zika inducido significativamente altos niveles de respuestas de anticuerpos cruz-reactivos de DENV que causaron ADE de DENV en ....

Protocol

Las muestras de suero utilizadas para demostrar el protocolo descrito aquí se obtuvieron de macacos rhesus que fueron alojadas y atendidas según local, estatal y federales políticas en una asociación para la evaluación y acreditación de laboratorio Animal Care Internacional (AAALAC)-acreditado centro. Todos los experimentos con animales fueron revisados y aprobados por el Comité de uso y cuidado institucional del Animal y las muestras fueron adquiridas a través de un tejido de intercambio de protocolo.

1. día 1

Nota: Realice todos los pasos que se describen a continuación en un gabinete de bioseguridad de flujo lam....

Results

Sera de 4 rhesus macacos fueron recogidos 16 semanas después de la infección con ZIKV y probaron por su potencial para mejorar el DENV-1, 2, 3 y 4 la infección en células K562. Los animales tenían viremia pico de ~ 1 x 10⁵ copias de ZIKV ARN/mL de plasma por día 3 después de la infección que se negó a niveles por debajo del límite de detección por 7 días después de la infección. No hay viremia se detectó en el plasma en la infección después de 16 semanas. Luego, se realizó el e.......

Discussion

Flaviviruses DENV como ZIKV compartir evidencia significativa de homología en ambos sus proteínas estructurales y no estructurales que generan anticuerpos que cruz-reaccionan con otros^13,14. Estas respuestas de anticuerpos cruz-reactivos se han demostrado para mejorar de la infección tanto en vivo como en vitro con un serotipo heterólogo u otros relacionados con flaviviruses^1,2. El poten.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DENV 1-4 RVP	Molecular integral	RVP-501
K562 células	ATCC	CCL-243
RPMI	Corning	10-040-CV
FBS	GE lifesceinces	SH 30910.03	10% FBS en RPMI-10
Penicilina-Estreptomicina	MP biomédicos	1670049	100 UI Pen/mL, 100 ug Estreptococo/mL en RPMI-10
HEPES	Cellegro	25-060-Cl	0.025M en RPMI-10
MEM Solución de aminoácidos no esenciales (100×)	Sigma	M7145	1x en RPMI-10
Piruvato de Sodio	Cellegro	25-000-Cl	1mM en RPMI-10
L-glutamina	Fisher Scientific MT25005CI
Placas inferiores en V estériles	Thomas Scientific	333-8001-01V
BD Falcon Polipropileno 5 ml Tubos FACS VWR		60819-728
Placas inferiores en U no estériles	Falcon	Ref 353910	Una alternativa de alto rendimiento a los tubos FACS 5
ml, estériles, pipeta serológica	Denville	P7127
200uL puntas	de pipeta estérilesPuntas	P3020 CPS
20uL	Pipeta multicanal Denville	P1121
50-200uL Pipeta	Denville	P3975-8-B
5-50uL	Denville	P3975-9-B
20% formadehído	Tousimis	#1008B
Baño de agua	ThermoFisher	TSCOL35
thermomixer	Eppendorf	2231000387	Una alternativa a un baño de agua para la inactivación del calor
Incubadora de CO2	ThermoFisher	13-998-213
Etanol	Sigma Aldrich	E7023
Lejía líquida	Fisher Scientific	NC9724348
Flowjo 9.8	TreeStar, Inc.		Software de análisis por citometría de flujo
BD FACSDiva 6.1.2	Becton Dikinson
Citómetro de flujo BD LSR II	Becton Dikinson
Liquid Bleach Fisher	Scientific	NC9724348