Het protocol stelt de Escherichia coli-selectieve druk opneming van niet-canonieke aminozuren (ncAAs) in het lactococcal antimicrobiële peptide nisine gebaseerd. De eigenschappen kunnen worden gewijzigd tijdens de recombinante expressie via substitutie met de gewenste ncAAs in de gedefinieerde groei media. Resulterende mutaties in de topicale worden toegewezen door groei remming testen en fluorescentie microscopie.
De natuur heeft een scala aan mogelijkheden nieuwe om eiwitfuncties te maken door het wijzigen van de volgorde van de bouwstenen voor de individuele aminozuur. Alle variaties zijn echter gebaseerd op de 20 canonieke aminozuren (burgerluchtvaartautoriteiten). Als een manier om aanvullende fysisch-chemische eigenschappen in polypeptiden, wordt de opneming van de niet-canonieke aminozuren (ncAAs) steeds meer gebruikt in Eiwittechnologie. Als gevolg van de relatief korte lengte is de wijziging van ribosoom gesynthetiseerde en post-translationally gewijzigde peptiden door ncAAs bijzonder aantrekkelijk. Nieuwe functionaliteiten en chemische handgrepen kunnen worden gegenereerd door specifieke wijzigingen van individuele residuen. De selectieve druk opneming (SPI) methode maakt gebruik van auxotrofe host stammen die zijn beroofd van een essentieel aminozuur in chemisch welbepaalde groei media. Verschillende structureel en chemisch soortgelijke aminozuur-analogen kunnen dan geactiveerd worden door de overeenkomstige aminoacyl-tRNA synthetase en bieden residu-specifieke cAA(s) → ncAA(s) vervangingen in het doel peptide of eiwit sequentie. Hoewel, in het kader van de SPI-methode, ncAAs zijn ook opgenomen in de host Proteoom tijdens de fase van recombinante genexpressie, worden de meerderheid van de cel van de middelen toegewezen aan de expressie van het target-gen. Hierdoor efficiënt residu-specifieke opneming van ncAAs vaak gepaard met hoge bedragen van gemodificeerde doel. Het gepresenteerde werk beschrijft de opneming in vivo van zes proline-analogen in de antimicrobiële peptide nisine, een natuurlijk geproduceerd door Lactococcus lactislantibioticum. Antimicrobiële eigenschappen van nisine kunnen worden veranderd en verder uitgebreid tijdens de gisting en expressie in de auxotrofe Escherichia coli stammen in gedefinieerde groei media. Daarmee kunnen de effecten van residu-specifieke vervanging van burgerluchtvaartautoriteiten met ncAAs wijzigingen leveren in antibacteriële activiteit en specificiteit. Antimicrobiële activiteit testen en fluorescentie microscopie worden gebruikt voor het testen van de nieuwe varianten van nisine voor groeiremming van een gram-positieve Lactococcus lactis indicator stam. Massaspectrometrie wordt gebruikt voor het bevestigen van de ncAA opneming in bioactieve nisine varianten.
De ontdekking van antibiotica in de twintigste eeuw en de parallelle ontwikkeling van nieuwe antimicrobiële verbindingen tegen pathogene micro-organismen ingeschakeld gerichte behandelingen voor bacteriële infecties. Echter, als gevolg van de opkomst van multiresistente pathogenen, zoals methicilline-resistente Staphylococcusaureus (MRSA), vancomycine-resistente enterokokken (VRE), MDR (multiresistente) Salmonella typhimurium faag typ 10 (DT10 ), en Klebsiella pneumoniae, het is dringend noodzakelijk voor het genereren van nieuwe antimicrobiële stoffen1. Antimicrobiële peptiden (AMPs) zijn veelzijdige, vaak zeer specifieke verbindingen die veelbelovende kandidaten voor de ontwikkeling van nieuwe geneesmiddelen dankzij hun fysisch-chemische eigenschappen, flexibiliteit, omvang, hydrophobicity en wijze van actie2 zijn. Versterkers zijn kleine peptiden, meestal bestaande uit 7-100 aminozuren. Vaak hebben ze een kationische structuur rijk aan positief geladen arginine en lysine residuen, die samenwerken met de gerichte microbiële celmembraan, die tegengesteld3 betaalt. Een bepaalde deelgroep van versterkers zijn ribosoom gesynthetiseerde en posttranslationally gewijzigde peptiden (RiPPs)4. Deze worden geproduceerd door vele organismen uit het Koninkrijk van schimmels en het domein van bacteriën. Een van de bekendste en meest gebruikte RiPPs is nisine, natuurlijk geproduceerd door de melkzuur-bacterie Lactococcus lactis (L. lactis). Actief tegen een panel van gram-positieve bacteriën, nisine is gebruikt als een biopreservative in de voedingsindustrie voor meer dan 50 jaar wegens haar antimicrobiële eigenschappen en het ontbreken van geëvolueerd weerstand in de gerichte microbiële stammen5. Studies hebben aangetoond dat nisinee destabiliseert en poriën in de bacteriële cel membranen, wat leidt tot antimicrobiële activiteit tegen zowel gram-positieve en gram-negatieve ziekteverwekkers6genereert. Door binding aan lipide II is de synthese van de bacteriële celwand geremde7. Nisine is gecodeerd door nisA als een voorloper van de lineaire peptide, die is samengesteld uit een leider en een core peptide regio (Figuur 1). Prenisin is na ribosomal synthese, eerst door de dehydratase NisB gewijzigd. Hier zijn de serine en threonine residuen in de regio prepeptide kern gedehydrateerde dehydroalanine (Dha) en dehydrobutyrine (Dhb)8. Vervolgens de gedehydrateerde residuen cysteïne tot formulier lanthionine ringen zijn gekoppeld (vandaar de naam “lantibioticum” voor lanthionine ring-bevattende antibiotica) door een enzym-gekatalyseerde Michael toevoeging. Deze posttranslationele wijziging (PTM) wordt gekatalyseerd door de cyclase NisC. In L. lactis, de gewijzigde prenisin is vervolgens vervoerd buiten de cel door vervoerder NisT en gekloofd de leider peptide is door de proteïnase NisP om de volwassen en actieve nisine formulier9vrij te geven. De verantwoordelijke leider peptidase NisP heeft een hoge substraat specificiteit, omdat het alleen processen gewijzigd nisine efficiënt10.
In het algemeen, voortvloeien active RiPPs uit de werking van PTM enzymen (bijvoorbeeld NisBC), die de chemische ruimte of korte peptides, bijvoorbeeld via acetylation, glycosylation, methylering fosforylatie drastisch te verhogen. Dit niveau van complexiteit kan verder worden uitgebreid door de directe integratie van ncAAs. Terwijl vaak haalbaar, is chemische synthese van versterkers een uitdaging voor grootschalige productie als gevolg van hun structurele complexiteit. Bijvoorbeeld, werd de totale chemische synthese van het lantibioticum lactosin S in stappen van 71 reactie bereikt met een definitieve rendement van 10% en die van nisine met een ruwe rendement van slechts 0.003%11,12. Biologische productie biedt daarom een levensvatbaar alternatief, als gevolg van de generatie van de juiste stereocenters en hoge product concentratie.
Tot vandaag, meer dan 150 ncAAs, bijvoorbeeld met functionele groepen met fluor of aziden, zijn opgenomen in de recombinante eiwitten, en diverse voorbeelden van gemodificeerde ncAA-AMPs geweest gerapporteerde13,14, 15,16. Met de introductie van ncAAs, kunnen roman fysisch-chemische eigenschappen worden gegenereerd ten opzichte van conventionele mutagenese. De diversiteit van de bestaande peptiden kan worden verhoogd, eventueel leiden tot nieuwe antibiotica.
Een methode voor de opneming van ncAAs in recombinante peptiden is selectieve druk opneming (SPI) gebaseerd op het gebruik van auxotrofe bacteriestammen17. Deze stammen zijn niet geschikt voor de synthese van het overeenkomstige cAA analogon van de ncAA. De methode maakt gebruik van de specificiteit van de vaak waargenomen ontspannen substraat, een functie van vele natuurlijke aminoacyl-tRNA synthetases (aaRSs)18. Afgezien van hun natuurlijke cAA substraten zijn deze enzymen vaak in staat te herkennen en de gewenste ncAA activeren en om het te laden op hun cognaat tRNA(s). Dit leidt tot ribosomal opneming van de ncAA in het doelproduct gen in een residu-specifieke manier (dat wil zeggen, cAA → ncAA substitutie). Dit is natuurlijk alleen mogelijk als de gewenste ncAA structureel en chemisch vergelijkbaar met het canonieke aminozuur is en getolereerd door de celfysiologie, de machine vertaling en de doelgroep peptide of eiwit sequentie. In een bepaalde experimentele opstelling, worden de auxotrofe gastheer cellen gekweekt in beschreven medium geleverd met een beperkende concentratie van het inheemse aminozuur te vervangen. De cellulaire groei of omruiling door cAA-gratis medium leidt tot uitputting van de intracellulaire van de cAA. In de volgende stap, de ncAA is toegevoegd en de genexpressie doel wordt geïnduceerd. Onvermijdelijk, ncAAs zijn nu ook verwerkt in veel andere eiwitten in de gastheercel tijdens deze fase van de target genexpressie. Echter de toxiciteit van de SPI-setup wordt gehouden op een laag niveau, omdat de Escherichia coli (E. coli)-stam wordt omgezet met een plasmide uitvoering van het target-gen onder controle van een sterke promotor (meestal de zeer concurrerende T7 promotor / RNA polymerase systeem)19. Onmiddellijk na de inductie (meestal wanneer de cAA is uitgeput), de gastheer cellen ophouden te groeien en hun cytoplasmatische enzymatische machineries worden hoofdzakelijk gebruikt voor expressie van het plasmide gebaseerde target-gen. Plaats-geleide mutagenese kan worden gebruikt om te definiëren van de site (s) van residu-specifieke ncAA installatie in de target-gen20.
Als een model voor de opneming van ncAAs peptide, werd het Pentacyclische AMP nisine A gekozen. Het is 34 aminozuren lange en heeft slechts een enkele proline residu in de kern peptide volgorde (Figuur 1). Zoals in subtilisin, ericin A en S en epidermin zo goed zoals in nisine Z en nisine Q lijkt de geconserveerde proline te zijn essentieel voor de activiteit9,21. De cAA proline speelt een bijzonder belangrijke rol in peptide-prolyl amide rotatie en de stabilisatie van de secundaire structuur. De zijketen ring conformaties (exo / endo plooien) zijn verantwoordelijk voor een thermodynamische stabilisatie van de amide-binding. Gerichte chemische wijzigingen (zoals hydroxyleringen, fluorinations, methyleringen) van prolyl plooien beïnvloeden vaak kritisch de opvouwbare stabiliteit, stijfheid van de steiger en functies van vele biologische structuren22. Het is dus aannemelijk te verwachten dat de Pro→ proline analoge substituties ring B, de tweede ring van nisine, met roman en ongebruikelijke eigenschappen begiftigen zal.
Hier, een proline-auxotrofe E. coli stam werd gebruikt voor de productie van recombinante nisinee. Dit vereist de expressie van het prepeptide gene nisA , alsmede de wijziging enzym genen nisBC. Het genetisch gecodeerde peptide-product draagt een N-terminaal zijn-gelabeld leider voor zuivering via de chromatografie van de affiniteit. Voor bepaling van de activiteit, wordt L. lactis uitdrukken en afscheidende NisPT gebruikt voor het activeren van de recombinante nisine varianten van E. coli cel lysates of gezuiverde peptide monsters (Figuur 1). De volwassen AMP wordt vrijgegeven na de splitsing van de leider door NisP. Bij deze methode agar diffusie het AMP monster diffundeert in het medium van de solide groei en kan remmen de groei van de gram-positieve micro-organisme. Na incubatie, kan dit visueel door groei remming halo’s worden nageleefd. Naast L. lactis als indicatie, bewerkt nisine varianten toonden een antimicrobiële activiteit tegen Enterococcus faecalis, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, es Lactobacillus johnsonii 21,23.
Er is een alternatieve en experimenteel verschillende methode op te nemen ncAAs in RiPPs stop codon onderdrukking (gcv)24. Hiervoor een orthogonale tRNA / aminoacyl-tRNA synthetase (jaarlijkse activiteitenverslagen) paar is vereist voor de bijbehorende ncAA. Idealiter zijn al deze drie componenten bioorthogonal, dat wil zeggen, zij geen interactie met de endogene tRNAs en aaRSs. De jaarlijkse activiteitenverslagen van een ncAA-specifieke kan worden gegenereerd door wijziging van het enzym actieve site en screening van genetische bibliotheken van mutant synthetases25. De invoering van een ncAA vereist bovendien een codon die opnieuw is toegewezen en die doet niet coderen voor de cAA. Meestal, is de amber stop codon gebruikte24,26.
Onlangs, SPI werd opgericht voor de opneming van α-chloroacetamide-bevattende en klik-chemie-compatibele ncAAs in NisA27. Bijvoorbeeld werd Nε– VERD-lysine ingelijfd bij de lasso peptide captistruin met site-specific (gcv) en residu-specifieke (SPI) opname methoden en vervolgens gewijzigd in vitro van ruthenium-gekatalyseerde Metathese28 . In vergelijking met SPI, de methode van SCS is ingewikkelder sinds een orthogonale tRNA / jaarlijkse activiteitenverslagen paar moet worden mede uitgedrukt. Tot op heden geweest o-paren voor proline inbouw ontwikkelde29, maar tot de beste van onze kennis, geen voorbeeld van proline analoge opname is gemeld.
Opgemerkt moet worden dat niet alle ncAAs kunnen worden opgenomen in de hand van de SPI-methodologie. Ten eerste, de opname van ncAAs in het cytoplasma wordt geregeld door een veelheid van vervoer eiwitten die zijn ingesloten in de cytoplasmatische membraan, dat de binnenste membraan voor gramnegatieve bacteriën zoals E. coli is. Normaal gesproken is E. coli is geschikt voor het vervoer van een breed scala van aminozuur-analogen in de cel met de zijketens structureel en chemisch vergelijkbaar met canonieke aminozuren. Tweede, veel chemisch reactieve of instabiele ncAAs zou kunnen fungeren als een inhibitor van de omwenteling naar cellulaire groei, zoals ze giftig zijn voor het metabolisme en fysiologie van de ontvangende cel30. Dus, de opname en de toxiciteit van de ncAA voor de productie-host moeten worden getest vooraf. Om te voorkomen dat de inactivering van de PTM machine als een bijwerking, een strikt gecontroleerde expressie setup van de verantwoordelijke genen kan worden gebruikt om het natuurlijke aminozuur integreren de wijziging enzymen (bijvoorbeeld nisBC) en de ncAA in het target-gen ( bijvoorbeeld, nisA). Dit kan worden bereikt met behulp van twee verschillende initiatiefnemers en inductie van doel genexpressie, zoals aangetoond in speciaal ontworpen SPI protocollen31. Zoals hierboven beschreven, berust de SPI-methode op de specificiteit van de ontspannen substraat van de jaarlijkse activiteitenverslagen, waarmee voor activering van de ncAA en cognaat tRNA opladen. Vervolgens wordt het tRNA geleverd aan het ribosoom gevolgd door amide binding vorming en vouwen van de doelgroep (poly) peptide. In deze processen, kunnen proeflezen en bewerken van mechanismen worden relevante32. Om deze redenen is het van groot belang voor het hebben van een doel ncAA dat structureel en chemisch lijkt op de cAA. Andere belangrijke punten zijn voldoende stabiliteit (zowel in de media van de groei en blootgesteld aan het cellulaire metabolisme) en oplosbaarheid van de ncAA. Bovendien moet het commercieel beschikbaar of gemakkelijk te chemisch gesynthetiseerd worden.
Hier beschrijven we een protocol voor SPI, waardoor residu-specifieke opneming van ncAAs in recombinante RiPPs. Met name, verschillende proline-analogen worden opgenomen in het antimicrobiële peptide nisine A met behulp van E. coli als ontvangende organisme. Massaspectrometrie wordt gebruikt om te controleren of aminozuur vervanging en peptide producten worden geanalyseerd op topicale met behulp van groei remming testen en fluorescentie microscopie met behulp van de indicator van de microbiële stammen.
De basisvoorwaarde voor succesvol recombinante nisine expressie met gedefinieerde ncAAs vereist een geschikt proline auxotrofe stam E. coli . Voor dit auxotrophy, proA moet disfunctionele, bijvoorbeeld bereikt door genomic knock-out. Cellen volledig verstoken van intracellulaire Pro biosynthese (dat wil zeggen, de verwijdering van proABC) zonder mogelijkheid om terugkeer zijn stabiele auxotrophs. Gebruikte gene knockout methoden zijn faag transductie of single-gen knockout volgens Datsenko & Wanner33. Bovendien kunnen proA knockout stammen worden verkregen uit openbare repositories zoals Addgene, CGSC of de Keio-collectie. Aangezien de expressie van de recombinante nisABC hier worden weergegeven, is afhankelijk van het gebruik van T7 initiatiefnemers, heeft de expressie host stam daartoe een afleidbare gen voor T7 RNA-polymerase. Dit kan worden bereikt door invoering van de λDE3 prophage in het genoom van de gastheer, bijvoorbeeld met behulp van de commerciële kit. Stammen zoals BL21(DE3) kunnen u auxotrofe zoals hierboven beschreven gemaakt worden.
Met behulp van SPI voor het inbrengen van proline-analogen, kunnen de gerichte nisine structuren aanzienlijk worden gewijzigd, het creëren van nieuwe peptide varianten met unieke reeks combinaties en chemische eigenschappen. Op deze manier kan de fundamentele grenzen van klassieke gentechnologie worden omzeild, die is beperkt tot de oplossingen van de ketting kant van de 20 burgerluchtvaartautoriteiten. In vivo chemische diversificatie van nisine zoals wordt geïllustreerd hierboven toont een algemene aanpak ter aanvulling van de natuurlijke PTMs en de chemische ruimte van RiPPs dramatisch te verbeteren. Wij zijn van mening dat uitbreiding van het repertoire van de natuurlijke aminozuren veelbelovend met name voor versterkers geldt. In eiwitten, kan een enorme scala aan functies worden gerealiseerd door een bepaalde regeling van de 20 burgerluchtvaartautoriteiten in driedimensionale structuren. Met slechts 7-100 aa in lengte3zou de manieren om te bereiken van dergelijke structurele functies alleen door de burgerluchtvaartautoriteiten beperkt voor versterkers. Het is dus niet verwonderlijk dat natuurlijke versterkers in de vorm van RiPPs vaak uitgebreid post-translationally gemodificeerde4 zijn. Op dezelfde manier, ncAAs als alternatieve bouwstenen houden grote belofte om hun farmacodynamische en farmacokinetische parameters (Zie Baumann et al. 201735 en verwijzingen daarin).
De SPI-methodologie gebruikt in dit werk profiteert van een relatief eenvoudig experimentele opzet, eenvoudige uitvoering en hoge reproduceerbaarheid. Als gevolg van de vervanging van het globale is multisite ncAA opneming in de target peptiden ook mogelijk. Aan de andere kant, kan de methode niet toereikend zijn voor vervanging van aminozuren die vaak voorkomen in het doelproduct gen. In principe, ongewenste posities kunnen worden gewijzigd door plaats-geleide mutagenese, maar deze extra wijzigingen kunnen ook van invloed op de verschillende AMP eigenschappen met inbegrip van structuur en topicale. Zodra een auxotrofe stam voor productie beschikbaar is, kunnen verschillende ncAAs worden getest zonder ingrijpende veranderingen op het genetische niveau. Bovendien, de methode is niet beperkt tot auxotrofe E. coli stammen, maar kan ook worden uitgevoerd met behulp van de natuurlijke productie-host. Zhou et al. blijkt bijvoorbeeld dat SPI voor productie van roman RiPPs werkt ook de natuurlijk Trp-auxotroph L. lactis: met behulp van media gedefinieerd, drie tryptofaan-analogen zijn opgenomen op vier posities in nisine50.
Aangezien de SPI-methode tot wereldwijde vervanging van de gekozen leidt cAA door de ncAA, het geldt in het algemeen tot een brede waaier van doel peptides en proteïnen. Een bereik van auxotrofe E. coli stammen beschikbaar is (zie stap 1), waardoor verschillende burgerluchtvaartautoriteiten elke te beproeven voor vervanging door ncAAs. Ontmoet analogen opgenomen met behulp van metA-deficiënte stammen (bijvoorbeeld B834(DE3)) zijn meestal in dienst. Voorbeelden van isostructural Met analogen zijn azidohomoalanine (Aha) en homopropargylglycine (Hpg), verkrijgbare ncAAs dat efficiënt kan worden opgenomen. Beide introduceren bioorthogonal handgrepen waarmee bijlage van moleculen die een compatibel alkyn of azide functionaliteit, respectievelijk. Bijvoorbeeld, fluorescente kleurstoffen of polyethyleenglycol (PEG) wordt kunnen worden bevestigd door de koper (I)-gekatalyseerde azide alkyn cycloadditie (CuAAC)51.
Hoewel beide recombinante ncAA opneming methoden (SPI en SCS) meestal bereiken doelstelling in voldoende hoeveelheden, opbrengsten zijn vaak gereduceerd ten opzichte van de wild-type productie van de overeenkomstige peptides en proteïnen. Zoals de purities vaak met productie-efficiëntie correleren, mogelijk extra zuivering stappen vereist, met name voor lage-overvloedig soorten. In dit specifieke geval van de productie van recombinante nisine vereenvoudigt de leider zijn-gelabeld volgorde RiPP zuivering door selectieve verrijking van de cel lysates. De zuivering wordt weergegeven in dit protocol verbetert de zuiverheid en de concentratie van nisine, maar vaak geen oplevert AMP purities volstaat het te bepalen van de opbrengst en de specifieke activiteit. Naast de IMAC, gebruikte AMP zuivering methoden omvatten HPLC, ion exchange chromatografie (IEC) en neerslag (bijv. met behulp van aceton of Trichloorazijnzuur (TCA)) of combinaties daarvan – resulterend in een meerstaps zuivering regeling52 . Opgemerkt moet worden dat hun algemeen polycationic natuur IEC zuivering kan vergemakkelijken. Vriesdrogen wordt vaak gebruikt voor het opslaan van gezuiverde versterkers.
In het ideale geval ncAAs voor inbouw in ampère moet commercieel verkrijgbaar tegen betaalbare prijzen of gemakkelijk geproduceerd door eenvoudige en reproduceerbare chemische synthese protocollen. Een even belangrijke voorwaarde voor de SPI-methode is dat de ncAA is herkend, geactiveerd en door de jaarlijkse activiteitenverslagen van endogene of mede uitgedrukt in rekening op de cognaat tRNA gebracht. Dit kan worden getest in vitro door aminozuur activering of tRNA aminoacylation assay53. Als een gemakkelijk alternatief, SPI test expressies van model eiwitten zoals groen fluorescente proteïne (GFP) uitgevoerd zowel in aanwezigheid en afwezigheid van ncAA suppletie kunnen worden uitgevoerd. Oplosbaarheid in het medium en cel permeabiliteit van de groei, evenals de chemische stabiliteit vormen bovendien belangrijke factoren.
In dit voorbeeld werd antimicrobiële activiteit vertoond met behulp van een gram-positieve indicator-stam. Als hij de leider peptidase NisP spreekt, wordt de laatste stap van nisine rijping gekatalyseerd. Verwijdering van de leider-reeks (zijne-gelabeld voor zuivering doeleinden) kan ook worden uitgevoerd in vitro door behandeling met gezuiverde NisP50 of trypsine54. Buiten het bestek van dit werk, kunnen pathogene organismen en multi-resistente stammen vervolgens worden getest voor bacteriostatische of bactericide remming door versterkers met behulp van een soortgelijke methodologie. Klinisch relevante doelsoorten omvatten MRSA, MDR Mycobacterium tuberculosis, VRE, immunodeficientie baumannii, Streptococcus pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa es Klebsiella pneumoniae. Naast de verspreiding van de plaat agar assay gepresenteerde, groei remming kan ook worden uitgevoerd met behulp van passende vloeibare media geënt met de bacteriesoorten en aangevuld met AMP. Met behulp van Bouillon verdunning methoden kan de minimaal remmende concentratie (MIC) worden bepaald met behulp van zuivere peptiden55. De bepaling van de activiteit hier gepresenteerd kan ook worden gebruikt om te schatten de topicale en potentie van AMP-bevattende ten opzichte van de referentiestoffen, bijvoorbeeld in de handel verkrijgbare nisine oplossingen.
Recombinante productie van RiPPs is vaak haalbaar39, waarin vaak mede expressie van genen die PTM. Zodra de productiestam wordt omgezet in een chemisch gedefinieerde of synthetische minimaal medium met een geschikt ncAA, plaatsvindt residu-specifieke vervanging van de overeenkomstige cAA. Dus kunnen andere RiPPs worden geproduceerd door dezelfde methode, mits hun recombinante productie haalbaar is en voorwaarden kunnen worden gevonden indien ncAA opneming en PTM voldoende hoeveelheden doelproduct opbrengst. Merk op dat naast de ontvangende cel Proteoom, de peptide PTM machine kan ook worden ncAA gemodificeerde tijdens SPI. Bijgevolg kunnen de timing van doel expressie inductie en lengte van de volgende incubatieperiode optimalisatie nodig. Aangezien ncAA opneming in de PTM enzymen kan invloed hebben op hun stabiliteit en activiteit, kan de productie van het verwerkte RiPP in principe worden beïnvloed. Voldoende PTM enzym werkzaamheid wordt aangegeven door de vorming van verwerkte prepeptide, zoals gedetecteerd door MS en topicale testen. Zoals hierboven geïntroduceerde, verschillende afleidbare initiatiefnemers kon worden ingezet om te produceren de PTM genen eerst (in afwezigheid van de ncAA) gevolgd door inductie van de voorloper van peptide gen in aanwezigheid van de ncAA. In het algemeen moet de productie van cAA-bevattende doel peptide worden onderdrukt vóór toevoeging van de ncAA, vandaar dat strakke onderdrukking van het gen voorloper is vereist. Binnen dit protocol, wordt dit bereikt door katabole repressie door de toevoeging van glucose aan het groeimedium. Vooral omdat de PTM enzymen nodig voor prepeptide verwerking zijn meestal afkomstig uit een genetisch verre host, kan expressie temperatuur en codon gebruik van de overeenkomstige genen nodig optimalisatie recombinante productie nog niet is opgericht. In principe, kan de aanwezigheid van ncAAs in de prepeptide interfereren met de opname en verwerking van de PTM enzymen, in het geval van nisine NisBC en NisP. Voor de opneming van de ncAA in ampère, dus verdient voor het uitvoeren van kleinschalige expressie experimenten eerst ter identificatie van geschikte expressie voorwaarden en de betrouwbaarheid van de bepaling van de activiteit AMP.
The authors have nothing to disclose.
J.H.N., T.B. en M.B. erkennen financiering door de EU FW7-programma (SYNPEPTIDE). F.-J.S. en T.F. erkennen financiering door het federale ministerie van onderwijs en wetenschap (goedgekeurd programma “HSP 2020”, TU-WIMIplus Project SynTUBio) en de Duitse Research Foundation (Cluster van Excellence “Unifying concepts in katalyse”).
sodium chloride | Carl Roth, Germany | P029 | |
guanidine hydrochloride | Carl Roth, Germany | 0035.2 | |
dipotassium hydrogen phosphate | Carl Roth, Germany | P749.3 | |
potassium dihydrogen phosphate | Carl Roth, Germany | 3904.3 | |
sodium dihydrogen phosphate monohydrate | Carl Roth, Germany | K300.2 | |
disodium hydrogen phosphate | Carl Roth, Germany | P030.2 | |
L-alanine | Carl Roth, Germany | 3076.2 | |
L-arginine | Carl Roth, Germany | 3144.3 | |
L-asparagine monohydrate | Carl Roth, Germany | HN23.1 | |
L-aspartic acid | Carl Roth, Germany | T202.1 | |
L-cysteine | Carl Roth, Germany | 3467.3 | |
L-glutamine | Carl Roth, Germany | 3772.1 | |
L-glutamic acid | Carl Roth, Germany | 3774.1 | |
L-glycine | Carl Roth, Germany | 3187.3 | |
L-histidine | Carl Roth, Germany | 3852.3 | |
L-isoleucine | Carl Roth, Germany | 3922.3 | |
L-leucine | Carl Roth, Germany | 3984.3 | |
L-lysine monohydrate | Carl Roth, Germany | 4207.2 | |
L-methionine | Carl Roth, Germany | 9359.4 | |
L-phenylalanine | Carl Roth, Germany | 4491.2 | |
L-proline | Carl Roth, Germany | T205.3 | |
L-serine | Carl Roth, Germany | 4682.4 | |
L-threonine | Carl Roth, Germany | T206.2 | |
L-tryptophan | Carl Roth, Germany | 4858.2 | |
L-tyrosine | Carl Roth, Germany | T207.2 | |
L-valine | Carl Roth, Germany | 4879.4 | |
ammonium sulfate | Carl Roth, Germany | 3746.3 | |
magnesium sulfate | Carl Roth, Germany | 0261.2 | |
D-glucose | Carl Roth, Germany | 6780 | prepare a 20% (w/v) solution for addition into molten agar |
calcium chloride | Carl Roth, Germany | PN93.2 | |
iron(II) chloride | Sigma-Aldrich, Germany | 372870 | |
thiamine hydrochloride | Sigma-Aldrich, Germany | T1270 | |
biotin | Carl Roth, Germany | 3822.2 | |
copper(II) sulfate | Merck, Germany | 102792 | |
manganese(II) chloride | Carl Roth, Germany | KK36.2 | |
zinc chloride | Merck, Germany | 108816 | |
immonium orthomolybdate | Sigma-Aldrich, Germany | 277908 | |
glycerol | Carl Roth, Germany | 7533.3 | |
isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside | Sigma-Aldrich, Germany | I6758 | |
ampicillin sodium salt | Carl Roth, Germany | K029.5 | working concentration 100 µg/mL for E. coli, prepare 100 mg/mL stock in ddH2O |
kanamycin sulfate | Carl Roth, Germany | T832.2 | working concentration 50 µg/mL for E. coli, prepare 50 mg/mL stock in ddH2O |
chloramphenicol | Carl Roth, Germany | 3886.1 | working concentration 5 µg/mL for L. lactis, prepare 37 mg/mL stock in ethanol |
(4S)-fluoroproline | Bachem, Switzerland | F-3970 | |
(4R)-fluoroproline | Bachem, Switzerland | F-3975 | |
(4S)-hydroxyproline | Bachem, Switzerland | F-1395 | |
(4R)-hydroxyproline | Bachem, Switzerland | F-2980 | |
(4S)-methanoproline | chemically synthesized | ||
(4R)-methanoproline | chemically synthesized | ||
hydrochloric acid (HCl) | Carl Roth, Germany | P074.4 | |
ethanol | VWR, Germany | 20825.324 | |
M17-broth | Sigmal-Aldrich, Germany | 56156 | commercial product, see Terzaghi BE & Sandine WE, Appl Microbiol., 1975, 29(6):807-13 for contents and preparation |
agar-agar | Carl Roth, Germany | 5210.5 | |
Nisin from Lactococcus lactis | Sigma-Aldrich, Germany | N5764 | commercial product, can be used as reference for bioactivity |
dimethyl sulfoxide (DMSO) | Carl Roth, Germany | A994.1 | |
imidazole | Carl Roth, Germany | 3899.3 | |
1.5 mL autosampler vial for LC-MS | Sigma-Aldrich, Germany | Supelco 854165 | |
acetonitrile | VWR, Germany | HiPerSolv CHROMANORM ULTRA for LC-MS, 83642 | LC-MS grade required |
formic acid | VWR, Germany | HiPerSolv CHROMANORM for LC-MS, 84865 | LC-MS grade required |
1 mL Ni-NTA IMAC column, e.g. HisTrap FF Crude | GE Healthcare, UK | 29-0486-31 | different manufacturers and resins available for IMAC |
0.45 µm bottle top filter unit | VWR, Germany | 10040-470 | sterile filtration of solutions using a vacuum pump |
0.45 µm syringe filter PVDF membrane | Carl Roth, Germany | CCY1.1 | sterile filtration of solutions using a syringe and to remove particles from cell lysates |
luer-lock syringe, PP, 50 ml | Carl Roth, Germany | T552.2 | sterile filtration of solutions |
1.5 mL Eppendorf tubes | Eppendorf, Germany | 30120086 | |
petri dishes (polystyrene, sterile) | Carl Roth, Germany | TA19 | |
Nile red | Sigma-Aldrich, Germany | 72485 | |
E. coli ΔproA strain | CGSC, Keio collection | JW0233-2 | proline-auxotrophic E. coli K-12 strain |
E. coli B834(DE3) | Novagen (Merck), Germany | 69041 | methionine-auxotrophic E. coli B strain |
λDE3 Lysogenization Kit | Novagen (Merck), Germany | 69734-3 | |
Lactococcus lactis NZ9000 pNG nisPT | bacterial indicator strain, see Khusainov R & Kuipers OP, PLoS One, 8 (9), e74890 | ||
benchtop centrifuge for 1.5 mL Eppendorf tubes | Eppendorf, Germany | 5427 R | |
peristaltic pump | GE Healthcare, UK | P1 | |
FPLC system | GE Healthcare, UK | Äkta Purifier 10 or the like | |
inverted microscope | Nikon | TI Eclipse wide-field fluorescence microscope with 100x (N.A. 1.4) objective and Mercury Lamp | example setup for fluorescence microscopy |
electron multiplying CCD (EMCCD) camera | Andor Technologies, UK | Andor Luca | example setup for fluorescence microscopy |
fluorescence excitation filter | Thorlabs, USA | Dichroic cube (TLV-U-MF2-TRITC) | example setup for fluorescence microscopy |
fluorescence emission filter | AHF Analysentechnik, Germany | T 560 LPXR | example setup for fluorescence microscopy |
cover slip 24 x 60 mm | Carl Roth, Germany | LH26.1 | example setup for fluorescence microscopy |
Immersion Oil | Carl Zeiss, Germany | Immersol 518 F | example setup for fluorescence microscopy |
probe sonicator | Bandelin, Germany | Sonopuls HD3200 with sonotrode MS-72 | 200 W maximum HF output |
C5 HPLC column (2.1×100 mm, 3 µm particle size) | Sigma-Aldrich, Germany | 567227-U | example setup for mass spectrometry |
ESI-TOF coupled to HPLC system | Agilent, USA | Agilent 6530 Accurate Mass QTOF with 1260 HPLC | example setup for mass spectrometry |