Generación de insulina libre de andamios, tridimensional expresar Pancreatoids de progenitores pancreáticos de ratón In Vitro

Summary

Aquí, presentamos un protocolo para generar insulina expresando 3D pancreatoids murino de e10.5 flotante disociado progenitores pancreático y el mesenchyme asociado.

Abstract

El páncreas es que un órgano complejo compuesto de muchos diferentes tipos de células que trabajan juntas para regular la digestión y la homeostasis de la glucosa de sangre. Estos tipos de células son las células acinares secretoras de enzimas, un sistema ductal arborized responsable para el transporte de las enzimas de las células endocrinas de las tripas y la producción de hormonas.

Endocrino de las células beta son el tipo celular único en el cuerpo que producen insulina para bajar los niveles de glucemia. Diabetes, una enfermedad caracterizada por una pérdida o disfunción de células beta, está alcanzando proporciones epidémicas. Por lo tanto, es indispensable establecer protocolos para investigar el desarrollo de las células beta que puede utilizarse para fines de investigación para obtener los medicamentos y terapias basadas en células. Mientras que la investigación experimental del desarrollo del ratón es esencial, en vivo los estudios son laboriosos y lentos. Las células cultivadas ofrecen una plataforma más conveniente para la investigación; sin embargo, no son capaces de mantener la diversidad celular, organización arquitectónica y las interacciones celulares que se encuentran en vivo. Por lo tanto, es esencial para desarrollar nuevas herramientas para investigar la fisiología y la organogénesis pancreática.

Pancreáticas células epiteliales se desarrollan en la asociación cercana con el mesénquima del inicio de la organogénesis como células organizan y diferencian en el complejo órgano adulto fisiológicamente competente. El mesénquima pancreático proporciona señales importantes para el desarrollo endocrino, muchos de los cuales no son bien entendidos todavía, por lo tanto difícil recapitular durante el cultivo en vitro . Aquí, describimos un protocolo cultura ratón complejo tridimensional, celular organoides que retienen mesenchyme, denominado pancreatoids. El brote pancreático murino e10.5 es disecado, disociado y cultivado en un ambiente libre de andamio. Estos flotan células auto montan con mesénquima que envuelven el desarrollo pancreatoid y un número sólido de endocrina las células beta en desarrollo junto con el acinar y las células del conducto. Este sistema puede ser utilizado para estudiar las interacciones de célula célula célula sino determinación, organización estructural y morfogénesis, organogénesis, o de drogas, de molécula pequeña o screening genético.

Introduction

Delinear los mecanismos del desarrollo normal y la fisiología es primordial para entender la etiología de la enfermedad y, en definitiva, cultivar métodos de tratamiento. Mientras que el cultivo y diferenciación de células madre permiten el análisis rápido y alto rendimiento de desarrollo, está limitada por el cuerpo existente de conocimientos sobre mecanismos de regulación sino de la célula y artificialmente recapitula el desarrollo en un relativamente Estado homogéneo bidimensional^1,2. En vivo desarrollo afectado por influencias extrínsecas, con diferentes tipos de células en el lugar y entorno prop....

Protocol

Todos los experimentos con animales se describe en este método fueron aprobados por el cuidado institucional de animales y uso Comité de Baylor College of Medicine.

1. preparación del ratón embrionario día 10,5 progenitores pancreáticos

Nota: Este Protocolo no necesita seguir en condiciones estériles hasta el paso 2, sin embargo, es óptima para esterilizar instrumentos de disección y rocíe con antes del etanol al 70% de uso.

1. Para configurar para la disección, llene un cubo de hielo y colocar un recipiente de tampón fosfato salino (PBS) en el hielo. Limpiar dos pinzas de punta fina y tijeras de disección....

Results

Disección cuidadosa de embriones de ratón en e10.5 desde el cuerno uterino debe producir embriones indemnes en PBS para más la disección (figura 1A). El tracto gastrointestinal puede eliminarse eficientemente del embrión (figura 1B), que permite el discernimiento del brote pancreático dorsal en la ensambladura del intestino y el estómago (figura 1C-F.......

Discussion

La progresión de los modelos de cultura de célula es fundamental para desarrollo de modelos de correctamente, producir tipos de células clínicamente relevantes, prueba de eficacia de los medicamentos o incluso trasplante a los pacientes. Sin embargo, recapitulando artificialmente el desarrollo en un plato es todo un reto ya que estamos todavía lejos de comprender los mecanismos de la organogénesis y la fisiología en vivo. Así en vitro de las células son ineficaz generado, no completamente funcional, inc.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Mercaptoetanol	Sigma-Aldrich	M6250
Conjuntos de tubos de aspiración para pipetas microcapilares calibradas	Sigma-Aldrich	A5177
BarnStead NanoPure Agua sin nucleasas	ThermoFisher	D119
Tubos capilares de borosilicato	Sutter Instruments	GB1007515	diámetro exterior 1 mm, diámetro interno 0,75 mm, 1,5 cm de longitud
CaCl2	Sigma-Aldrich	C5080
Repelente de células Microplaca de 96 pocillos	Greiner Bio-One	650970	de fondo en U
5424 R	Eppendorf	5401000013
Cloroformo	Sigma-Aldrich	233306
Anticuerpo de cromogranina-A	Abcam	ab15160
Microscopio estereoscópico compacto y modular M60	Leica
Countess Contador de Células Automatizado	Invitrogen	C10310
Countess Contador de Células Portaobjetos	Invitrogen	C10312
CryoStar NX70	ThermoFisher	957000L
D-(+)-Glucosa	Sigma-Aldrich	G7528
DAPI (4',6-diamidina-2'-fenilindol-diclorhidrato)	Roche	10 236 276 001	Polvo
DBA anticuerpo	Vector Lab	RL-1032
Dispasa II, Polvo	Gibco	17105041
DMEM/F-12, HEPES	Gibco	11330032
Dnase I	Invitrogen	18068-015
Dumont #5 Pinzas	Fine Science Tools	11251-10	0,05 x 0,02 mm; Titanio; Consejo de biología
EGF (factor de crecimiento epidérmico)	Sigma-Aldrich	E9644
Etanol, 200 Proof	Decon Laboratories	2716
Incubadoras de CO2 de ciclo estéril ThermoFisher		370
Fluoromount-G	Southern Biotech	OB10001
Heparina sal sódica de la mucosa intestinal porcina	Sigma-Aldrich	H3149-10KU
Anticuerpo INSM1	Santa Cruz BioTechnology	sc-271408	Isopropanol policlonal de ratón IgG
	Fisher	A4164
Isothesia Isoflurano, USP	Henry Schein	11695-6776-2
Anticuerpo de insulina	Dako	A056401	conejillo de indias policlonal
KAPA SYBR FAST Universal	KAPA Biosystems	KK4618
KCl	KaryoMax	10575090
KnockOut Serum Reemplazo	Invitrogen	10828028
Leica TCS SPE Espectral de Alta Resolución Confocal	Leica
MgCl2	Sigma-Aldrich	442615
Ratón C-Péptido ELISA	ALPCO	80-CPTMS-E01
Ratón Ultrasensible Insulina ELISA	ALPCO	80-INSMSU-E01
MX35 Cuchillas de micrótomo	ThermoFisher	3052835
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S3817
NaH2PO4	Sigma-Aldrich
Suero de burro normal	Jackson Immuno Research	017-000-121
Paraformaldehído	Sigma-Aldrich	158127
PBS 1X	Corning	21-040-CV
Anticuerpo Pdx1	DSHB	F6A11	Ratón monoclonal MIgG1
Peel-A-Way Moldes de inclusión desechables	VWR	15160-157
Solución de penicilina-estreptomicina	Corning	MT30002CI
PMA (Forbol 12-Miristato 13- Acetato)	Sigma-Aldrich	P1585
Protein LoBind Tubos de microcentrífuga	Eppendorf	22431081	1,5 mL de capacidad
FGF-10 humano recombinante Proteína	R& D Systems	345-FG
FGF humano recombinante-Ácido	Peprotech	100-17A
R-Spondin I humano recombinante Proteína	R& D Systems	4546-RS
BenchRocker 2D	Benchmark	BR2000
Sacarosa 500g	Sigma-Aldrich	S0389
SuperFrost Plus Portaobjetos de microscopio	Fisher Scientific	12-550-15
Super Pap Pen	Microscopía Electrónica Sciences	71310
Thermomixer R	Eppendorf	05-412-401
Tissue Tek O.C.T. Compuesto	Sakura	4583
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
TRIzol Reactivo	Invitrogen	15596018
TrypLE Express	Invitrogen	12604039	(1x), sin Rojo Fenol
Tinción Azul de Tripán	Invitrogen 15250061		Para portaobjetos de recuento de células
Tripsina-EDTA (0,05% )	Corning	25-052-CI
Tripsina-EDTA (0,25%)	Gibco	25200072	rojo fenol
Placa de 24 pocillos de fijación ultrabaja	Corning	3473
Placa de esferoide de fijación ultrabaja	Corning	4520
Anticuerpo de Vimentina	EMD Millipore	AB5733	Pollo policlonal IgY
Vortex Genie	BioExpres	S-7350-1
Y-27632 Dihidrocloruro	R& D Systems	1254	También conocido como inhibidor de ROCK
Zeiss 710 Microscopio confocal	Zeiss