Este manuscrito describe un protocolo para estudiar el efecto antimicrobiano de terapia fotodinámica mediada por el ácido de 5-aminolevulínico (ALA-PDT) en el biofilm de Staphylococcus aureus . Este protocolo puede utilizarse para desarrollar un modelo de vitro para estudiar el tratamiento de los biofilms bacterianos con TFD en el futuro.
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Artículo de método
Un modelo In Vitro para estudiar el efecto de la terapia fotodinámica mediada por el ácido aminolevulínico 5 de Biofilm de Staphylococcus aureus
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En este artículo
Resumen
Resumen
Staphylococcus aureus (S. aureus) es un patógeno humano común, que causa infecciones piógenas y sistémicas. S. aureus las infecciones son difíciles de erradicar no sólo debido a la aparición de cepas resistentes a los antibióticos pero también su capacidad de forma biofilms. Recientemente, la terapia fotodinámica (TFD) ha indicado como uno de los posibles tratamientos para el control de las infecciones de biofilm. Sin embargo, se necesitan estudios adicionales para mejorar nuestro conocimiento de su efecto sobre biofilms bacterianos, así como los mecanismos subyacentes. Este manuscrito describe un modelo in vitro de la TFD con ácido 5-aminolevulínico (5-ALA), un precursor de la actual fotosensibilizador, protoporfirina IX (PpIX). Brevemente, maduro S. aureus biopelículas fueron incubados con ALA y entonces expuestos a la luz. Posteriormente, el efecto antibacteriano de ALA-PDT en el biofilm de S. aureus fue cuantificado calculando las colonias formando unidades (UFC) y visualizado por tinción mediante láser confocal de barrido (CLSM) la microscopia fluorescente de viabilidad. Resultados representativos demostraron un fuerte efecto antibacteriano de ALA-PDT en biopelículas de S. aureus . Este protocolo es simple y puede utilizarse para desarrollar un modelo de vitro para estudiar el tratamiento de los biofilms de S. aureus con ALA-PDT. En el futuro, también podría hacer referencia en los estudios de PDT utilizando otros photosensitizers por diferentes cepas bacterianas con ajustes mínimos.
Introducción
S. aureus es un importante patógeno gram-positivo que coloniza la piel y mucosa de los ejércitos humanos. Su capacidad de forma biofilms se considera un aspecto importante de su patogenesia1. Biofilms bacterianos son una comunidad de bacterias embebidas en una matriz de producción propia, que se compone de sustancias poliméricas extracelulares, incluyendo polisacárido, ADN y proteínas. Esta matriz juega un papel importante en la persistencia de las infecciones bacterianas, que contribuyen a un alto grado de resistencia al sistema inmunológico humano y terapias antimicrobianas actuales2. Antibióticos siguen siend....
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Protocolo
1. Biofilm formación
-
Formación de biopelículas en microplacas de 96 pocillos
- Recuperar la S. aureus cepa USA300 y 3 formación de biofilm clínicas cepas (C1 - C3) almacenadas a-80 ° C.
Nota: La capacidad de las cepas clínicas para formar biofilms se determinó por el ensayo de placa de microtitulación descrito previamente15. - Inocular la bacteria en medio de 5 mL triptona soja caldo (TSB) y cultivan en una incubadora con agitación a 37 ° C durante la noche a la fase estacionaria.
- Centrifugar el cultivo bacteriano durante la noche a 4.000 x g por 10 min a 25 ° C y luego descart....
- Recuperar la S. aureus cepa USA300 y 3 formación de biofilm clínicas cepas (C1 - C3) almacenadas a-80 ° C.
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Resultados
La viabilidad de las bacterias en los biofilms disminuyó después del tratamiento de ALA-PDT en comparación con los controles (ALA - LED-, ALA + LED - y ALA-LED +) USA300 y las tres cepas clínicas (figura 1).
Para confirmar los resultados de la UFC de ensayo y observan el anti-bacteriano efecto de ALA-PDT en el S. aureus biofilm en situ, el USA300 biofilms se visualizaron por CLSM c.......
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Discusión
PDT ha sido una terapia muy estudiada para el tratamiento del cáncer desde que fue inventado hace más de 100 años18. En la última década, PDT ha sido aplicada como una estrategia antimicrobiana y ha mostrado eficacia contra algunas bacterias patógenas resistentes a los antibióticos12. En comparación con el estado planctónico, biopelículas bacterianas parecen ser más resistentes al tratamiento antibiótico3, mientras que el efecto de ALA-PDT en biofilm.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por la nacional naturaleza ciencia Fundación de China para jóvenes académicos (Nº 81300810), programa de formación de médico joven de Shangai (Nº 20141057) y Fundación de Ciencias naturales nacionales de China (81671982, 81271791 y 81571955). Nos gustaría dar las gracias a LetPub (www.letpub.com) para prestar asistencia lingüística durante la preparación de este manuscrito.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Caldo de Soja de Triptona (TSB) | OXOID | CM0129B | |
| Agar de Soja de Triptona (TSA) | OXOID | CM0131 | |
| SYTO9 | Thermo Fisher Scientific | L7012 | Los Kits de Viabilidad Bacteriana BacLight VIVOS/MUERTOS |
| Yoduro de propidio (PI) | Thermo Fisher Scientific | L7012 | Los kits de viabilidad bacteriana BacLight VIVOS/MUERTOS |
| Pancreatina | Sigma-Aldrich | P3292 | |
| Ácido 5-aminolevulínico (ALA) | Fudan Zhangjiang Bio-Pharm | 3.1 | |
| Staphylococcus aureus cepa USA300 | / | / | La fuente de las referencias de USA 300 " Tenover FC, Goering RV. J Quimiotera antimicrobiana. septiembre de 2009; 64(3):441-6". |
| Staphylococcus aureus cepas clínicas (C1-C3) | / | / | Todas las cepas clínicas se aislaron de pacientes con rinosinusitis crónica en el Departamento de Otorrinolaringología-Cirugía de Cabeza y Cuello, Hospital Oftalmológico y Otorrinolaringólogo de la Universidad de Fudan [Zhang QZ, Zhao KQ, Wu Y, et al. PLoS One. 2017 Mar; 12(3): e0174627]. |
| Microplaca de 96 pocillos | Corning Inc | 3599 | Poliestireno transparente de fondo plano Microplacas tratadas con TC, envueltas individualmente, con tapa, |
| fluoroplato | NEST Biotechnology | 801001 | Fondo de vidrio, no pirogénico |
| Tubos Eppendorf Safe-Lock, 1,5 mL | Microcentrífuga Eppendorf | 0030120086 | |
| Eppendorf 5417 | Eppendorf | Z365998 | Incubadora SIGMA | |
| Thermo Fisher Scientific | SHKE4000 | MaxQ 4000 Agitadores orbitales de sobremesa | |
| Diodo emisor de luz (LED) | Wuhan Yage Técnica óptica y electrónica CO | LED-IB | |
| Microscopio de barrido láser confocal Leica TCS SP8 | Leica Microsystems | ||
| Leica LAS AF Software | Leica Microsystems | ||
| IMARIS Plano de bits |
Referencias
- Lewis, K. Riddle of biofilm resistance. Antimicrob Agents Chemother. 45 (4), 999-1007 (2001).
- Rabin, N., et al. Biofilm formation mechanisms and targets for developing antibiofilm agents. Future Med Chem. 7 (4), 493-512 (2015).
- Mah, T. F., O'Toole, G. A.
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Reimpresiones y permisos
