Aquí presentamos un método robusto para reprogramar fibroblastos embrionarios primarios en cardiomiocitos funcionales a través de la sobreexpresión de GATA4, Hand2, Mef2c, Tbx5, miR-1 y miR-133 (GHMT2m) junto con la inhibición de la señalización de TGF-β. Nuestro protocolo genera cardiomiocitos paliza tan pronto como transducción después de 7 días con hasta un 60% eficiencia.
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Artículo de método
Supresión de la señalización Pro-fibróticos potencia Factor-mediada la reprogramación de fibroblastos embrionarios de ratón en cardiomiocitos inducida
En este artículo
Resumen
Resumen
Trans-diferenciación del tipo de una célula somática en otro tiene un enorme potencial para modelar y tratar enfermedades humanas. Estudios anteriores han demostrado que ratón embrionario, fibroblastos cutáneos y cardíacos pueden ser reprogramados en células similares de cardiomiocitos inducida funcionales (iCMs) a través de la sobreexpresión de factores de transcripción cardiogénico como GATA4, Hand2, Mef2c, y TBX5 in vitro e in vivo. Sin embargo, estos estudios previos han demostrado la eficacia relativamente baja. Para restablecer la función del corazón después de lesiones, mecanismos que regulan la reprogramación cardiaca deben ser aclados para aumentar la eficiencia y la maduración del iCMs.
Previamente demostramos que la inhibición de la señalización pro-fibróticos dramáticamente aumenta la eficiencia de reprogramación. Aquí, se detallan métodos para alcanzar una eficiencia de reprogramación de hasta un 60%. Además, se describen varios métodos incluyendo la citometría de flujo, imagen inmunofluorescente y proyección de imagen de calcio para cuantificar la eficiencia de reprogramación y la maduración de reprogramado fibroblastos. Utilizando el protocolo detallado aquí, pueden realizarse estudios mecanísticos para determinar los reguladores positivos y negativos de reprogramación cardiaca. Estos estudios pueden identificar vías de señalización que pueden ser dirigidas para promover la eficiencia de reprogramación y la maduración, que podría conducir a terapias celulares nuevos para el tratamiento de enfermedades del corazón humano.
Introducción
Cardiopatía isquémica es la principal causa de muerte en los Estados Unidos1. Aproximadamente 800.000 estadounidenses experimentan un primera o recurrente infarto de miocardio (IM) por año1. Después de MI, la muerte de los cardiomiocitos (CMs) y la fibrosis cardiaca, depositado por los fibroblastos cardiacos activados, afectar corazón función2,3. Progresión de la insuficiencia cardíaca después de MI es en gran medida irreversible debido a la pobre capacidad de regeneración de adultos CMs4,5. Mientras que ....
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Protocolo
Todos los experimentos que requieren animales fueron aprobados por el cuidado institucional de animales y uso en la UC Denver Anschutz Medical Campus.
1. aislamiento de MEFs
- Comprar ratones C57BL/6 embarazadas E13. Nave durante la noche.
- Eutanasia a la madre según protocolos aprobados de IACUC (ex: ~1.3 CO L/min2 hasta que el animal aparece muerto seguido por dislocación cervical)
- La madre del aerosol con etanol al 70% y abrir la cavidad abdominal. El cuerno uterino que contiene embriones de Quite y coloque en un plato de 10 cm con PBS estéril.
- Hacer una incisión en el saco del embrión para....
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Resultados
Usando la estrategia de reprogramación descrita anteriormente y en la figura 1B, generamos iCMs con aproximadamente 70% de las células cardiacas de troponina T y aproximadamente 55% de las células cardiaca α-actinina, cuantificado por citometría de flujo en el día 9 después de transducción de GHMT2m (figura 2A y B). Además, la mayoría de las células expresa cardiaca troponina T, troponina I y α-actinina cardiaca .......
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Discusión
El presente estudio esboza una estrategia de alta eficiencia para directamente reprogramar fibroblastos en iCMs funcional vía entrega de GHMT2m reprogramación factores combinados con la supresión de vías de señalización pro-fibróticos. Mediante citometría de flujo, la proyección de imagen inmunofluorescente, calcio imaging y superando a un recuento, nos muestran la mayoría de las células en este protocolo se someten a reprogramación exitosa y adoptar sino del linaje de CM. Previamente hemos demostrado que la adición de a.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Esta investigación fue apoyada por fondos de la Fundación Boettcher Webb Waring biomédica investigación programa, americano corazón Asociación científico desarrollo Grant (13SDG17400031), Departamento de la Universidad de Colorado de destacada carrera medicina Programa, de la Universidad de Colorado División de Cardiología Barlow Nyle dotación y R01HL133230 de NIH (a K.S). ASR fue apoyado por NIH/NCATS Colorado CTSA concesión número TL1TR001081 y una beca predoctoral del consorcio Universidad de Colorado para la investigación de la Fibrosis y traducción (CFReT). Esta investigación fue apoyada también por la concesión de apoyo Centro de cáncer (P30CA046934), beca de nú....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| C57BL/6 Ratones | Laboratorio de Charles River | 027 | Para el aislamiento de MEF |
| Células de platino E (PE) Cell | Biolabs, INC | RV-101 | Para la producción de retrovirus |
| DMEM High Glucose | Gibco | SH30022. FS | Componente de iCM, PE y medios de crecimiento |
| Medio 199 | Life Technologies | 11150-059 | Componente de iCM |
| Suero Fetal Bovino | Gemini | 100106 Componente de iCM, PE y medios de crecimiento | |
| Donante Suero de caballo | Gemini | 100508 500 | Componente de iCM Media |
| MEM Aminoácidos esenciales, 50X | Life Technologies | 11130051 | componente de iCM Solución |
| piruvato de sodio, 100X | Life Technologies | 11360070 | componente de los medios iCM y para la obtención de imágenes de calcio |
| MEM Aminoácidos no esenciales, 100X | Life Technologies | 11140050 | componente de los medios iCM |
| Solución vitamínica MEM, 100X | Life Technologies | 11120-052 | Componente de los medios iCM |
| Insulina-Transferrina-Selenio | Gibco | 41400045 | Componente de los medios iCM |
| B27 | Gibco | 17504-044 | Componente de los medios iCM |
| Penicilina-Estreptomicina | Gibco | 15140-122 | Componente de iCM, PE y medios de crecimiento |
| GlutaMAX (suplemento de L-glutamina) | Gibco | 35050-061 | Componente de iCM, PE y medios de crecimiento |
| Blasticidina-HCl | Life Technologies | A11139-03 | Componente de los medios PE |
| Dihidrocloruro de puromicina | Life Technologies | A11138-03 | Componente de medios PE |
| 0.25% Tripsina/EDTA | Gibco | 25200-056 | Para separar células de placas de cultivo |
| A-83-01 | R& D Systems - Tocris | 2939/10 | Tratar las células para inhibir la señalización de TGF-β - promueve la reprogramación de alta eficiencia. Uso a 0.5 y micro; M |
| DMSO | Thermo Scientific | 85190 | Para la dilución y el almacenamiento de A-83-01 y componente del medio de congelación |
| SureCoat | Cellutron | SC-9035 | Para el recubrimiento de placas para placas MEFs |
| FuGENE 6 Reactivo de transfección | Promega | E2692 | Reactivo de transfección |
| Opti-MEM Medios de suero reducido | Gibco | 11058-021 | Reactivo |
| de transfecciónpBabe-X Myc-GATA4 | Plásmido que contiene factor de reprogramación | ||
| pBabe-X Myc-Hand2 | Plásmido que contiene | ||
| pBabe-X Myc-Mef2c | Plásmido que contiene factor de reprogramación | ||
| pBabe-X Myc-Tbx5 | Plásmido que contiene factor de reprogramación | ||
| pBabe-X miR-1 | que contiene factor de reprogramación | ||
| pBabe-X miR-133 | Plásmido que contiene factor de reprogramación | ||
| pBabe-X GFP | Plásmido que contiene factor de reprogramación | ||
| Polibreno (bromuro de hexadimetrina) | Sigma | H9268-5G | Para la inducción viral. Úselo a una concentración de 6 y micro; g/mL |
| Filtro de vacío + botellas (0.22 y micro; m poros) | Nalgene | 569-0020 | Para filtrar medios |
| Jeringas | Bd Vacutainer Labware | 309654 | Para filtración viral |
| 0.45 y micro; m Filtros | Celltreat | 229749 | Para filtración viral |
| 70 µ coladores de células m | Falcon | 352350 | Para aislamiento de MEF y citometría de flujo |
| , Cytofix/Cytoperm, solución | BD | 554722 | Para la fijación y permeabilización de células para citometría de flujo |
| , tampón de lavado/permanente | BD | 554723 | Para células de lavado para citometría |
| de flujo DPBS 1X | Gibco | 14190-250 | Para células de lavado |
| Albúmina sérica bovina | VWR | 0332-100g | Para citometría de flujo e imágenes de calcio |
| Suero de cabra | Sigma | G9023 | Para el bloqueo de células para Citometría de Flujo |
| Serum Sigma | D9663-10mg | Para el bloqueo de células para Citometría de Flujo | |
| Troponina de ratón T | Thermo Scientific | ms-295-p | 1:400 IF, 1:200 Citometría de flujo |
| de ratón α-actinina | Sigma | A7811L | 1:400 IF, 1:200 Citometría de flujo |
| Rabbit Connexin 43 | Sigma | C6219 | 1:400 IF |
| Troponina de conejo I | PhosphoSolutions | 2010-TNI | 1:400 IF |
| Hoechst | Life Technologies | 62249 | 1:10000 IF |
| Alexa 488, conejo | Life Technologies | A-11034 | 1:800 IF |
| Alexa 555, ratón | Life Technologies | A-21422 | 1:800 IF |
| Alexa 647, ratón | Life Technologies | A-31571 | Citometría de flujo 1:200 Citómetro |
| flujo ZE5 de 27 colores | Bio-RAD | para FACS | |
| Paraformaldehído | sigma | P6148-500mg | Para la fijación de células para IF |
| Triton X-100 | Promega | H5142 | Para la permeabilización de células para IF |
| EVOS™ Sistema de imagen en color FL | Thermo Scientific | AMEFC4300 | para IF |
| NaCl | RPI | S23020-5000 | Para la adquisición de imágenes de calcio |
| KCl | VWR | 395 | Para la adquisición de imágenes |
| de calcio CaCl2 | Fisher | C614-500 | Para la adquisición de imágenes de calcio |
| MgCl2 | VWR | 97061-352 | Para la adquisición de imágenes |
| glucosa | sigma | G7528-250g | Para la obtención de imágenes de calcio |
| HEPES | sigma | H4034-500g | Para la obtención de imágenes |
| de calcio Fura-2 AM | Life Technologies | F1221 | Para la obtención de imágenes |
| de calcio Fluronic F-127 | Sigma | P2443-250g | Para la obtención de imágenes de calcio |
| Nifedipino | Sigma | N7634-1G | Para la interrupción de los transitorios de calcio en los iCM - uso a 10 & micro; M |
| Isoproterenol | sigma | I6504-1g | Para aumentar el número de transitorios de calcio en iCMs - uso en 1-2 µ M |
| Marianas Spinning Disk Microscopio confocal | 3i | Para la obtención de imágenes de calcio | |
| etanol | Decon Laboratories | 2801 | |
| lejía | Clorox | ||
| 50 mL tubos cónicos | GREINER BIO-ONE | ||
| 227261 15 mL tubos cónicos | GREINER BIO-ONE | ||
| 188271 15 cm placas de cultivo celular | Falcon | ||
| placas de cultivo celular de 10 cm | Falcon | 353003 | |
| placas de cultivo celular de 60 mm | GREINER BIO-ONE | 628160 | |
| placas de cultivo celular de 6 pocillos | GREINER BIO-ONE | 657160 | |
| Placas de cultivo celular de 12 pocillos | GREINER BIO-ONE | 665180 | |
| Placas de cultivo celular de 24 pocillos | GREINER BIO-ONE | 662160 |
Referencias
- Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 136 (20), (2017).
- Laflamme, M. A., Murry, C. E. Regenerating the heart. Nat. Biotechnol. 23 (7), 845-856 (2005).
- Mercola, M., Ruiz-Lozano, P., Schneider, M. D.
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Reimpresiones y permisos
