Vi presenterar strategier för biofysiska och strukturella karakterisering av glykoproteiner med immunglobulin luckan genom biolayer interferometri, isotermiska titrering kalorimetri och röntgenkristallografi.
Glykoproteiner på ytan av celler spelar avgörande roller i cellulär funktion, inklusive signalering, vidhäftning och transport. På leukocyter, flera av dessa glykoproteiner äger immunglobulin (Ig) veck och är central för immun erkännande och förordning. Här presenterar vi en plattform för design, uttryck och biofysiska karakterisering av det extracellulära området av mänsklig B cell receptor CD22. Vi föreslår att dessa metoder är generellt tillämpliga på karakterisering av däggdjur glykoprotein ectodomains innehållande Ig domäner. Två suspension mänskliga embryonala njurar (HEK) cellinjer, HEK293F och HEK293S, används för att uttrycka glykoproteiner hysande komplexa och hög-mannos glycans, respektive. Dessa rekombinanta glykoproteiner med olika glycoforms att undersöka effekten av glycan storlek och sammansättning på ligand bindande. Vi diskutera protokoll för att studera kinetik och termodynamik av glykoprotein bindningen till biologiskt relevanta ligander och terapeutiska antikroppar kandidater. Rekombinanta glykoproteiner produceras i HEK293S celler är mottagliga för kristallisering på grund av glycan homogenitet, minskad flexibilitet och känslighet för endoglycosidase H behandling. Vi presenterar metoder för blötläggning glykoprotein kristaller med tunga atomer och små molekyler för fas bestämning och analys av liganden bindande, respektive. De experimentella protokoll som diskuteras håll här löftet för karakterisering av däggdjur glykoproteiner att ge inblick i deras funktion och undersöka verkningsmekanismen av therapeutics.
Ytproteiner spelar avgörande roller i cellulär funktion. Genom sin extracellulära domäner, kan dessa membranproteiner modulera cell-cell interaktioner, vidhäftning, transport och signalering1,2. Extracellulära lokaliseringen av dessa proteiner gör dem attraktiva mål för utveckling av läkemedel för behandling av ett brett spektrum av sjukdomar, inklusive cancer och autoimmuna sjukdomar3,4,5 , 6 , 7. en av de vanligaste veck av mänskliga membran protein ectodomains är immunglobulin-liknande (Ig) luckan, som bildas av sju eller fler β-trådar ordnad in i två β-ark8,9. Ig-innehållande glykoproteiner är vanligtvis multi-domän strukturer med Ig domäner sekventiellt ordnade på den extracellulära delen av membran protein10. Post-translationella modifieringar av dessa cellytan proteiner, särskilt N – och O-länkade glycosylation, har visat att spela avgörande roller i deras reglering, vikning, sekretion och funktion11. För att förbättra vår förståelse av deras funktion och bättre design therapeutics som kan rikta dem, krävs tekniker som möjliggör deras detaljerade molekylär karakterisering. Här presenterar vi en kombination av tekniker som möjliggör de biofysiska (biolayer interferometry (BLI) och isotermiska titrering calorimetry (ITC)) och strukturella (röntgenkristallografi) karakterisering av det extracellulära området av Ig-innehållande membranet glykoproteiner, ensamma och i komplex med sin biologiskt relevanta ligander och terapeutiska molekyler (figur 1).
N-länkade glycosylation är en av de vanligaste efter översättning ändringarna på protein från däggdjur, och uppstår under protein mognad inom endoplasmatiska retiklet och Golgi12,13. Cellinjer, såsom mänskliga embryonala (HEK) 293 njurceller, har utvecklats av rekombinant uttryck för stora mängder glykosylerat protein från däggdjur14,15. Denna cellinje har utvecklats i en suspension-format, vilket möjliggör enkel skala upp proteinproduktion till större mängder jämfört med vidhäftande cellinjer. Här, vi använder två HEK293 cellinjer: HEK293F och HEK293 Gnt jag– / – (HEK293S), som skiljer sig genom avsaknad av N-acetylglucosaminyl transferas jag (Gnt jag) i det senare. I sin produktion av komplexa glycans (som ses i HEK293F) är inte möjligt och istället hög mannos-typ glycans (huvudsakligen Man5GlcNAc2) bosatt i N-länkade glycan platser18,19,20 . När du använder dessa två cellinjer parallellt kan studera effekten av glycan storlek och komplexitet på biologisk funktion och terapeutisk inriktning. Faktiskt, glykoproteiner som produceras i HEK293F celler kommer att ha större och mer komplexa glycans jämfört med den samma glykoprotein som produceras i HEK293S celler. Glykoproteiner som produceras i HEK293S celler är mer mottagliga för kristallisering, på grund av sin N-länkade glycans minskade kemiska och konfirmerande heterogenitet. För att ytterligare förbättra crystallizability, glykoproteiner som produceras i HEK293S (men inte HEK293F) celler kan behandlas med det enzym endoglycosidase H (Endo H), vilket resulterar i klyvning av hög mannos glycans sådan att endast en enda N-acetylglukosamin (GlcNAc) biexponentiellt förblir varje N-länkade glycosylation webbplats21,22. Andra metoder kan också användas för att begränsa N-glycan bearbetning i cellerna, till exempel tillägg av glycosyltransferase-hämmare under glykoprotein uttryck, inklusive kifunensine23. Alternativa metoder innebär uttrycket av infödda glykoproteiner (i HEK293F celler) följt av enzymatisk deglycosylation med peptid N-glycosidase F (PNGaseF). Dock har deglycosylation med PNGaseF visat sig vara mindre effektivt under inhemska förhållanden och ökar aggregation i vissa proteiner; i fall när proteinet förblir vattenlöslig efter behandling, förvärvar det negativa laddningar på ytan på grund av deamidation av aminosyran asparagin restmängd till asparaginsyra24, som kan vara till nackdel för dess kristallisering. Förutspådda N-glycosylation platser kan också vara muterade, oftast till alanin eller glutamin rester, att förhindra N-länkade glycosylation på dessa platser och att generera glykoprotein prover av hög homogenitet. Alternativt kan glykoproteiner produceras i andra eukaryota cellkulturer, inklusive jäst, insekt, och växt-system eller andra däggdjursceller linjer såsom kinesisk hamster cystor (CHO) celler16,17.
Många däggdjur uttryck vektorer, inklusive pHLsec, möjliggöra utsöndringen av rekombinant glykoprotein ectodomains in i cellen medium25. Utsöndringen av glykoproteiner från HEK293 celler möjliggör snabb och enkel rening utan behov av cellys. Tillägg av rening Taggar (t.ex. hans-tag, Strep-tag, flagg-tagg, Myc-tagg, HA-tag) till N eller C slutstationen för målet glykoprotein möjliggör rening av en enda steg affinitetskromatografi. Därefter kan storlek utslagning kromatografi användas för att ge en monodisperse prov för biofysiska och strukturell karaktärisering.
En mycket ren och homogen glykoprotein prov under lämpliga förhållanden kan resultera i väl diffracting kristaller. När en full röntgendiffraktion datamängd har erhållits från dessa kristaller, måste inledande faserna fastställas att beräkna elektrontätheten av glykoprotein. Tack vare ett ständigt ökande antal strukturer i Protein Data Bank (PDB) blivit den vanligaste metoden för att fasa överlägset molekylär ersättning (MR), som använder en relaterade proteinstruktur för att få inledande faserna26. När herr misslyckas på fas problemet, som ibland har varit fallet för multi-Ig domän glykoproteiner27,28,29, krävs dock alternativa metoder. I denna artikel detalj vi en metod att suga kristaller med tunga atomer (HA) för avvecklingen, som krävdes för att lösa strukturen CD22 ectodomain28. Identifiera rätt HA för utfasning är en iterativ process som beror på HA reaktivitet, tillgängliga atomer i glykoprotein i en given kristallgitter och kristallisering lösning30,31. Alternativt, naturligt svavel atomer i cystein och metionin restprodukter kan användas för att fasa om närvarande vid en tillräckligt hög i förhållande till andra atomer i glykoprotein och röntgendiffraktion kan samlas med tillräckligt hög redundans32, 33.
Den biologiska funktionen av membran glykoproteiner är ofta medieras av protein-protein interaktioner eller protein-ligand interaktioner, såsom med kolhydrater. När liganden är tillräckligt liten för att sprida lösningen till glykoprotein bindningsstället i det crystal gallret, kan blötläggning experiment lyckas att få ett glykoprotein-ligand samtidig kristallen strukturerar för att bättre förstå ligand erkännande.
De protokoll som presenteras här är också relevant för att förstå samspelet mellan surface glykoproteiner med syntetiska terapeutiska ligander34,35 och antikropp therapeutics36,37. Kombination med strukturell information, kan bindande kinetik och termodynamik vara kraftfulla att förstå och förbättra deras verkningsmekanismer. En teknik som möjliggör den kinetiska analysen av terapeutiska antikroppar som binder till ett glykoprotein är BLI38,39. BLI använder biosensorer med en orörlig ligand för att mäta association och dissociation kinetik med en bindande partner, att slutligen bestämma en jämvikt dissociationskonstant (KD). BLI är en attraktiv metod eftersom små mängder av glykoproteiner krävs (< 100 µg), experiment tid är snabb (~ 10-15 min per körning), och det kan vara automatiserad. ITC är också användbart för att studera släktskap mellan glykoproteiner och bindande partner40,41,42,43. ITC är mer tid och reagens intensiv, kan värdefull information erhållas om termodynamik vid interaktionen (ΔG, ΔH, ΔS och stökiometri). ITC är också mycket användbart för att studera svaga interaktioner som ofta förknippas med övergående bindningen av surface glykoproteiner till ligander. Dessa tekniker kan dessutom användas i samband att utvärdera bindningen av olika konstruktioner och bedöma effekten av olika N-länkade glycoforms erhålls från att uttrycka glykoprotein i olika cellinjer. Utför BLI och ITC med glykoproteiner produceras i HEK293F, HEK293S och behandlade med Endo H kan ge en fördjupad bild av glycans roll i biologiska aktivitet och terapeutiska engagemang.
Vi tillämpat framgångsrikt dessa protokoll för att karakterisera den extracellulära domänen (ECD) av mänskliga CD2228, ett glykoprotein medlem av familjen sialic acid-bindande Ig-liknande lektiner (Siglecs) som är nödvändig för att upprätthålla B-cell homeostas44 . Vi utförde djupgående konstruktion konstruktion att underlätta kristallisation och fasas röntgen datamängden av HA blötläggning med Hg. Vi också indränkt CD22 kristaller med dess ligand sialic acid (α2-6 sialyllactose) att få en struktur av immun receptor-ligand komplexet och därmed enligt ritningarna struktur-guidad utformningen av glycan mimetika45,46. Dessutom genererade vi fragment antigen bindningen (Fab) av den anti-CD22 terapeutiska antikroppar epratuzumab – terapeutiska kandidat för närvarande i kliniska fas III-prövningar för non-Hodgkins lymfom47– för att avgöra dess affinitet av BLI och ITC till differentially glykosylerat CD22 ECD konstruktioner. Dessa studier visade en avgörande roll för N-länkade glycosylation i epratuzumab engagemang, med potentiella konsekvenser för CD22 erkännande på dysfunktionella B-celler.
Membran-förankrade glykoproteiner är avgörande för cellens funktion och attraktiva terapeutiska mål. Här presenterar vi ett protokoll för strukturella och biofysiska karakterisering av direktivet om elektronisk handel av membran glykoproteiner, både ensam och i komplex med liten molekyl ligander och Fab fragment. Vi har framgångsrikt använt detta protokoll för att bestämma kristallstrukturen av de tre N-terminal-mest Ig domänerna i den extracellulära delen av mänskliga CD2228, en kritisk samtidig receptor på B-celler som är involverade i att hålla humorala immuniteten i kontrollera79. Vi har också kännetecknas bindande platsen för CD22 med dess naturliga ligand α2-6 sialyllactose och definitionen av erkännande terapeutiska antikroppar mot mänskliga CD22. Dessa resultat ger insikter om relationen struktur och funktion av en viktig medlem av familjen Siglecs som har begränsat uttryck på B-celler och en molekylär färdplan för utvecklingen av nya CD22 riktade liten molekyl och antikroppsbaserade Therapeutics. Medan detta protokoll användes framgångsrikt för en Ig-innehållande B-cells receptor, föreslår vi att vår strategi kan tillämpas för strukturella och biofysiska karakterisering av någon membran glykoprotein med en distinkt domän organisation. I sådana fall konstruera design och kombinatoriska N-länkade glycan mutationer (antingen till Gln eller Ala) kan utvärderas för att hitta en konstruktion passar crystal tillväxt och högupplösta diffraktion.
Att erhålla en homogen och ren glykoprotein prov är av avgörande betydelse för crystal tillväxt och röntgendiffraktion, liksom för nedströms biofysiska karakterisering. N-länkade glycans närvarande på glykoproteiner är till sin natur heterogen och kan orsaka konfirmerande och kemiska heterogenitet inom den glykoprotein som kan avskräcka crystal bildandet. För att minska denna mikro-heterogenitet, kan strategier som införa punktmutationer ta bort Asn rester förutspådde för att hysa N-länkade glycans, eller använda muterade cellinjer (såsom HEK293S) följt av behandling med endoglycosidases (till exempel EndoH) avsevärt förbättra kristallisering framgång15,21,22. I detta protokoll diskuterar vi rening av lösliga glykoproteiner och Folkesson som utsöndras in i cellen supernatant. Glykoprotein sekretion ger en relativt enkel rutt mot renhet, utan behovet av cellys eller tillägg av starka kemikalier eller rengöringsmedel. Cell supernatanten, erhåller följande cell skörd körs sedan direkt över en kolumn som har affinitet för proteinet av intresse (t.ex., Ni-NTA för hans-taggade glykoproteiner eller LC affinitet för Fab fragment). Dock beroende på kolumnen i användning och cellens supernatant (t.ex. pH), kan bindande förmåga av proteinet av intresse för kolumnen påverkas. Om så är fallet, kan det vara nödvändigt att koncentrera sig och buffert exchange cellen supernatanten för att förbättra bindning till kolumnen. Dessutom rekommenderas att kvalitetskontroll steg under reningen användas för att bedöma protein renhet. Kör en SDS-PAGE gel eller Western blot av alla prover (före, under och efter reningssteg) kan ge insikter om föreslagna rening systemet är lämpligt för proteinet av intresse. Om kontaminerande band syns på SDS-PAGE, eller om flera arter erhålls under reningen (t.ex. flera toppar på storlek utslagning), ytterligare reningssteg bör övervägas, t.ex., jonbyteskromatografi, att få i renhet och öka chanserna för nedströms kristallisering80.
För makromolekylära kristallisering är det ofta avgörande för att få hög avkastning av proteinet av intresse att tillåta för screening av ett stort antal potentiella kristallisering villkor vid hög proteinhalt koncentrationer att hitta lämplig crystal hits. Generellt, de HEK293 cellinjer diskuteras här (HEK293F och HEK293S) är robust uttryck system, och kan skalas enkelt för att producera fler prov som behövs. Det är dock möjligt att proteinet av intresse inte kan uttrycka tillräckligt inom dessa cellinjer. I dessa fall andra cellinjer, såsom Expi293 celler81,82, har befunnits Visa överlägsna nivåer av proteinuttryck och bör betraktas som ett alternativ.
Om välordnade, diffracting kristaller inte erhålls efter provning av flera konstruktioner av proteinet av intresse trots hög renhet, kan det vara nödvändigt att utöka kristallisering tekniker för att främja crystal bildandet. Det har visat att Fab fragment av antikroppar och nanobodies kan vara utmärkta kristallisering smakförstärkare och främja välordnad crystal packning83,84,85. Dessa fragment kan vara uttryckt renas till homogenitet och används i ett komplex med proteinet av intresse för att främja kristallisering. Ännu viktigare, kan Fab fragment producerade som beskrivs i avsnitt 10 ha en tendens att bilda icke-funktionella LC dimerer86. Dessa dimerer föroreningar och bör tas bort under reningen. I vår erfarenhet, LC dimerer ofta har en annan lagring volym på storlek utslagning, eller eluera som en distinkt topp på jonbyteskromatografi och således kan tas bort från Fab rening – men detta inte är alltid fallet. Om dessa metoder är otillräckliga för att ta bort LC dimerer från Fab rening, kan ytterligare reningsmetoder, såsom Protein G affinitet rening, användas för att förbättra branschrenheten.
Alternativ till co-komplexering med Fab fragment, väldokumenterade tekniker såsom slumpmässiga matrix microseeding kan förbättra chanserna att få välordnad kristaller63,70. Denna metod innebär tillsats av små mängder av krossade, suboptimal kristaller till kristallisation villkoret, som ger en kristall nucleate att främja crystal tillväxt. Detta kan utföras med kristaller av proteinet av intresse, eller de med liknande domän arkitektur och tertiär struktur. Dessutom kan slumpmässiga matrix microseeding utföras i försök att kristallisera proteinet ensam eller i komplex med en Fab-fragment eller liten molekyl av intresse. Senaste framstegen inom cryo-elektronmikroskopi gör också denna teknik ett attraktivt alternativ till röntgenkristallografi för att erhålla högupplöst strukturell information för molekyler med lämpliga funktioner87,88, 89,90,91.
När utfasningen av röntgendiffraktion datamängder misslyckas av herr, kan HA blötläggning behövas på fas problemet genom avvikande spridning eller isomorft utbyte. Inspektion av den amino syra ordnar av protein kan ge ledtrådar om strategin för HA derivatisering, inklusive optimalt pH för bindning. I synnerhet kan oparade cysteines inom proteinet specifikt binda HA föreningar som innehåller kvicksilver. Blötläggning infödda kristaller med HA föreningar är en iterativ process för att fastställa identiteten för optimal HA föreningen, dess koncentration och krävs inkubationstiden. Om inledande blötläggning försök inte ger väl diffracting kristaller innehållande en HA lämplig för avveckling, kan det nödvändigt att införa aminosyra substitutioner för att förbättra sannolikheten att HA bindande och förbättra avvikande signal. Exempel är mutationer för att inkludera en gratis cysteinrest för att effektivt binda Hg, Au, Pt eller Pb. redovisning av proteiner för avvikande fasa i en seleno-metionin kompletteras media i E. coli används flitigt för att avvikande fasa, men en likvärdigt system som på ett tillförlitligt sätt innehåller seleno-metionin är inte lätt tillgängliga för däggdjursceller i suspension92,93, och är ett område för framtida utveckling.
När den unliganded strukturen i glykoprotein sevärdheter erhålls, kan blötläggning kristallerna med liten molekyl ligander utföras för att erhålla en struktur av immun receptor-ligand komplexet. Dessa data ger en blåkopia för rationell utformning av mer specifika och hög affinitet ligander som kan användas som småmolekylär therapeutics samt ger hög upplösning insikter i den biologiska funktionen av glykoprotein. När du försöker att suga glykoprotein kristaller med liten molekyl ligander sevärdheter, kan inspektion av unliganded kristallstrukturen indikera om blötläggning ska vara möjligt. Om nära crystal-packning kontakter finns runt ligand-bindningsstället eller runt regioner förväntas genomgå konfirmerande förändringar vid ligand bindande, blötläggning kommer troligen vara problematiskt. I det här fallet, bör andra metoder såsom samtidig kristallisation av protein-ligand anläggningen utföras.
The authors have nothing to disclose.
Röntgendiffraktion experiment som beskrivs i denna uppsats utfördes med linjer 08-ID och 08-BM på den kanadensiska ljuskällan, som stöds av stiftelsen Kanada för Innovation, naturliga vetenskaper och Engineering Research Council of Canada, den University of Saskatchewan, regeringen i Saskatchewan, västra ekonomisk diversifiering Kanada, Kanadas National Research rådets och de kanadensiska instituten av hälsoforskning. Vi skulle vilja erkänna de strukturella & biofysiska Core Facility, sjukhuset för sjuka barn, för tillgång till instrument som ITC och BLI. J.E.O. stöddes av Banting postdoc Fellowship BPF-144483 av kanadensiska institut för hälsa forskning. T.S. är mottagare av en Kanada Graduate stipendium Master Award och Vanier Kanada Graduate stipendium av kanadensiska institut för hälsa forskning. Detta arbete stöds av löpande bidrag PJT-148811 (J.-P.J.) av kanadensiska institut för hälsa forskning. Denna forskning utfördes, delvis tack vare finansiering från programmet Kanada forskning stolar (J.-P.J.).
0.22 μm Steritop filter | EMD Millipore | SCGPS02RE | |
10 well 4-15% gradient SDS-PAGE gel | Bio-Rad | 4561084 | |
10x glycobuffer 3 | New England Biolabs | P0702S | Comes with Endo H reagent |
10x Kinetics Buffer | PALL FortéBio | 18-1092 | |
10x Tris/Glycine/SDS Buffer | Bio-Rad | 1610732 | |
1 mL round bottom 96 well block | ThermoFisher | 260251 | |
22 mm cover slip | Hampton research | HR3-231 | |
4x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610747 | |
96-3 well INTELLIPLATE low volume reservior | Art Robbins Instruments | 102-0001-03 | |
AgeI | New England Biolabs | R0552S | |
ÄKTA Pure | GE Healthcare | ||
ÄKTA Start | GE Healthcare | ||
Amicon Ultra 15 centrifugal filtration device 10KDa MWCO | Millipore | UFC901008 | |
Amicon Ultra 4 centrifugal filtration device 10KDa MWCO | Millipore | UFC801008 | |
Auto-iTC200 | Malvern | ||
Axygen MaxyClear Snaplock 1.5 mL microtubes | Fisher Scientific | MCT150C | |
Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
CryoLoop 18 x 0.05-0.1 mm | Hampton research | HR4-945 | |
CryoLoop 18 x 0.1-0.2 mm | Hampton research | HR4-947 | |
CryoLoop 18 x 0.2-0.3 mm | Hampton research | HR4-970 | |
Digital Dry Bath | Bio-Rad | 1660562EDU | |
E. coli DH5α | Invitrogen | 18258012 | |
Endo H | New England Biolabs | P0702S | |
Erlenmeyer flask (baffled base), polycarbonate, sterile, 500 mL, DuoCAP | TriForest Labware | FBC05000S | |
Erlenmeyer flask 125 mL (baffled base), polycarbonate, sterile, 125 mL with vented cap | VWR | 89095-258 | |
Falcon Disposable sterile serological pipet, non-pyrogenic, 10 mL | Greiner Bio-One | 607180 | |
Falcon Disposable sterile serological pipet, non-pyrogenic, 25 mL | Greiner Bio-One | 760180 | |
Falcon Disposable sterile serological pipet, non-pyrogenic, 5 mL | Greiner Bio-One | 606180 | |
Falcon Disposable sterile serological pipet, non-pyrogenic, 50 mL | Greiner Bio-One | 768180 | |
FectoPRO DNA Transfection Reagent, Polyplus | VWR | 10118-842 | |
Freestyle 293F cells | Thermo Fisher Scientific | R79007 | |
Freestyle Expression medium | Thermo Fisher Scientific | 12338001 | |
Heavy Atom Screens Au | Hampton research | HR2-444 | |
Heavy Atom Screens Hg | Hampton research | HR2-446 | |
Heavy Atom Screens M1 | Hampton research | HR2-448 | |
Heavy Atom Screens M2 | Hampton research | HR2-450 | |
Heavy Atom Screens Pt | Hampton research | HR2-442 | |
HEK 293S | ATCC | ATCC CRL-3022 | |
HisTrap Affinity Column | GE Healthcare | 17525501 | |
HiTrap KappaSelect Affinity Columns | GE Healthcare | 17545811 | |
HiTrap LambdaSelect Affinity Columns | GE Healthcare | 17548211 | |
KpnI | New England Biolabs | R0142S | |
MCSG-1 Crystal Screen 1.7 mL block | Anatrace | MCSG-1 | |
MCSG-2 Crystal Screen 1.7 mL block | Anatrace | MCSG-2 | |
MCSG-3 Crystal Screen 1.7 mL block | Anatrace | MCSG-3 | |
MCSG-4 Crystal Screen 1.7 mL block | Anatrace | MCSG-4 | |
Mercuric chloride | Sigma | 1044170100 | |
Microplate, 96 well, polypropelene, flat bottom, black | Greiner Bio-One | 655209 | |
Minstrel DT UV | Formulatrix | ||
Multitron Pro shaker | Infors HT | MP25-TA-CO2HB | |
Nanodrop 2000/2000c Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | |
Nanosep 3K Omega centrifugal device | PALL Life Science | OD003C33 | |
Ni-NTA biosensors | PALL FortéBio | 18-5102 | |
Octet RED96 | PALL ForteBio | ||
Oryx 4 crystallizaiton robot | Douglas Instrument | ORY-4/1 | |
Platinum chloride | Sigma | 520632-1g | |
Precision Plus Protein Standard | Bio-Rad | 161-0374 | |
PureLink HiPure Plasmid Maxiprep Kit | Invitrogen | K210006 | |
Quick Coomassie Stain | Protein Ark | GEN-QC-STAIN-1L | |
Steriflip Sterile 50 mL Disposable Vacuum Filtration System 0.22 µm Millipore Express | EMD Millipore | SCGP00525 | |
Superdex 200 Increase 10/300 GL | GE Healthcare | 28990944 | |
Superose 6 10/300 GL | GE Healthcare | 17517201 | |
Tantalum bromide cluster | Jena bioscience | PK-103 | |
Top96 Crystallization Screen | Rigaku Reagents | 1009846 | |
Tryphan Blue | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
VDX 24-well with sealant | Hampton research | HR3-172 | |
α2-6 sialyllactose | Sigma Aldrich | A8556-1mg |