Aquí se describe un protocolo simple y bien validado para medir la actividad de autofagia secuestro a granel en células de mamíferos. El método se basa en cuantificar la proporción de lactato deshidrogenasa (LDH) en fracciones celulares de sedimentables en comparación con los niveles de LDH celulares total.
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Artículo de método
El ensayo de secuestro del lactato deshidrogenasa, Es un método Simple y confiable para determinar la actividad de autofagia secuestro a granel en células de mamíferos
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Resumen
Resumen
A granel la autofagia se caracteriza por el secuestro de grandes porciones de citoplasma en estructuras de doble/múltiple-membrane denominado autophagosomes. Aquí se describe un protocolo simple para controlar este proceso. Además, se proporcionan resultados típicos y validación experimental del método bajo condiciones de inducción autofagia en varios tipos de células mamíferos cultivadas. Durante autofagia a granel, autophagosomes secuestrar citosol y así también soluble proteínas citosólicas, junto a otras cargas de autofagia. LDH es estable y muy abundante, soluble enzima citosólica que selectivamente no es secuestrado en autophagosomes. La cantidad de secuestro de LDH por lo tanto refleja la cantidad de secuestro autofagia a granel. Determinar eficientemente y exactamente secuestro de LDH en las células, empleamos un protocolo basado en electrodisruption fraccionamiento que separa efectivamente sedimentables de LDH citosólica, seguido por la medida de la actividad enzimática en sedimentables fracciones versus muestras celulares. Secuestro de autofagia se determina restando la proporción de sedimentables LDH en las células no tratadas de eso en células tratadas. La ventaja de la prueba de captura de LDH es que da una medida cuantitativa de la autofagia secuestro de carga endógena, en comparación con otros métodos que o bien implican expresión ectópica de sondas de captura o proteasa semi-cuantitativo Análisis de marcadores de autofagia o receptores de protección.
Introducción
Autofagia (griego para "la comer") es un proceso evolutivo conservado vacuolar/lysosomal degradación de material intracelular. Al descubrimiento de los genes relacionados con la autofagia ("ATG"), que son importantes para la autofagia en levaduras y humanos, y la realización que la autofagia juega un papel importante en la salud y enfermedad (reconocido por el Premio Nobel en medicina o fisiología a 2016 Yoshinori Oshumi), autofagia ha convertido rápidamente en uno de los procesos más intensamente estudiados en biología de la célula1,2.
Macroautophagy (en lo sucesivo, "autofagia") e....
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Protocolo
1. célula siembra y tratamiento
-
Células adherentes en cultivo en frascos de cultivo de tejidos2 de 75 cm en una incubadora humidificada con 5% CO2 a 37 ° C, utilizando el medio de cultivo recomendado: para el tipo de célula en cuestión. Permitir a las células a crecer hasta llegar a una capa de la célula cerca del confluente.
Nota: Use Medio RPMI 1640 suplementado con 10% suero fetal bovino (FBS) de LNCaP, HEK293, fibroblastos embrionarios del ratón (MEFs), BJ, MCF-7 y las células RPE-1.- Lavar las células con 3 mL 37 ° C con tampón fosfato salino (PBS), pH 7,4. Sustituya el PBS por 3 mL 0.25% tripsina-ethyle....
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Resultados
Usando el protocolo descrito aquí, la actividad de autofagia secuestro a granel en un número de líneas de diferentes células de mamífero, incluyendo LAPC4, DU145, Huh7, PNT2A, HeLa, VCaP, H3122, Hec1A, MCF-7, T47D, U2OS, PC3, G361, ratón (MEFs) los fibroblastos embrionarios, RPE-1, Se midió las células HEK293, BJ y LNCaP. Secuestro fue evaluado bajo condiciones basales (en medio completo, rico en nutrientes), o en células muy hambrientos de suero y aminoácidos (un bona fide induc.......
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Discusión
En Resumen, el protocolo descrito aquí representa un método fiable y ampliamente aplicable para monitorear la actividad de autofagia secuestro a granel en células de mamíferos. Comparado con el original método12,16, hemos eliminado una serie de pasos innecesarios, simplificado a varios de los pasos restantes e introdujo una sustancial reducción de resolución. Como resultado, el protocolo es mejorado en relación a costo y tiempo-eficiencia, y ahora se puede maneja.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflicto de interés.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado financieramente por el Consejo de investigación de Noruega, la Universidad de Oslo, la Anders Jahre Foundation, la Fundación de Nansen y el legado en la memoria de Henrik Homan. Agradecemos a Dr. Noboru Mizushima para el ATG5 + / + MEFs y ATG5/MEFs, Dr. Masaaki Komatsu para la ATG7 + / + MEFs y ATG7/MEFs y Dr. Shizuo Akira para el ATG9A + / + MEFs y ATG9A/MEFs. Agradecemos Frank Sætre asistencia técnica, y el Dr. por Seglen O. constructivas discusiones metodológicas.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Tubos de microcentrífuga de 1,5 mL y 2 mL | Placas Eppendorf | 211-2130 y 211-2120 | |
| de 12 pocillos | Solución | ||
| Accumax | Innovative Cell Technologies | A7089 | Mantenga las alícuotas en -20 C durante años, y en la nevera durante unos meses |
| Bafilomycin A1 | Enzo | BML-CM110-0100 | Disolver en |
| células DMSO BJ | ATCC | CRL-2522 | uso en el paso < 30 |
| Albúmina sérica bovina (BSA) | VWR | 422361V | |
| Cámara de recuento Burker | Fisher Scientific | 139-658585 | |
| Countess Cámara de recuento de células Portaobjetos | ThermoFisher Scientfic | C10228 | |
| Countess II Contador de células automatizado | ThermoFisher Scientfic | AMQAX1000 | |
| Cubreobjetos para la cámara | de recuento BurkerFisher Scientific | 139-658586 | |
| Criterion Tris-HCl Gel, 4– 20%, 26 pocillos, 15 y micro; L, 13,3 cm x 8,7 cm (ancho x largo) | Bio-Rad | 3450034 | |
| TDT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Solución salina equilibrada de Earle (EBSS) | Gibco | 24010-043 | contiene glucosa al 0,1% |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E7889 | |
| Cubeta de electroporación (4 mm) | Bio-Rad | 1652088 | |
| Electroporador de onda de decaimiento exponencial | BTX Harvard Aparatos | EMC 630 | |
| Suero fetal bovino (FBS) | Sigma | F7524 | 10% de concentración final en medio RPMI 1640 |
| células HEK293 | ATCC | CRL-1573 | |
| Imidazol | Sigma-Aldrich | 56750 | Autoclave una solución de 65 mM y mantener en la nevera durante meses |
| Incubadora; Incubadora de CO2 de calor directo IR Autoflow | NuAire | NU-5510E | |
| Lipofectamine RNAiMAX Reactivo de transfección | ThermoFisher | 13778150 | |
| células LNCaP | ATCC | CRL-1740 | uso en el paso < 30 |
| 3-metil adenina (3MA) | Sigma-Aldrich | M9281 | stock 100 mM en RPMI en -20 °C. Caliente el caldo a 65 ° C durante 10 min y uso a una concentración final de 10 |
| mM Microcentrífuga refrigerada | Beckman Coulter Life Sciences | 368831 | |
| Microcentrífuga refrigerada con función de modo suave | Eppendorf | Eppendorf 5417R | |
| Clorhidrato de MRT67307 (ULKi) | Sigma-Aldrich | SML0702 | Inhibe la actividad de la quinasa ULK. Disolver en DMSO. |
| Instrumento multianalizador MaxMat | Erba Diagnostics | PL-II | |
| Celdas MCF7 | ATCC | HTB-22 | |
| NADH | Merck-Millipore | 1.24644.001 | |
| Nycodenz | Axis-Shield | 1002424 | |
| Opti-MEM Medio de suero reducido | ThermoFisher | 31985062 | |
| solución salina tamponada con fosfato (PBS) | Gibco | 20012-019 | |
| Puntas de pipeta 3 (0.5-20 y micro; L) | VWR | 732-2223 | Thermo Fischer ART Puntas |
| barrera Puntas de pipeta (1-200 y micro; L) | VWR | 732-2207 y nbsp; | Puntas de barrera Thermo Fischer ART |
| Puntas de pipeta (100-1.000 y micro; L) | VWR | 732-2355 y nbsp; | Puntas de barrera Thermo Fischer ART |
| Pipetas | ThermoFisher | 4701070 | Finnpipette F2 GLP Kit |
| Poly-D-lisina | Sigma-Aldrich | P6407-10X5MG | Prepare una solución madre de 1 mg/mL en H2O estéril. Esta solución es estable a -20 ° C durante al menos 1 año. |
| Piruvato | Merck-Millipore | 1066190050 | |
| células RPE-1 (hTERT RPE-1) | ATCC | CRL-4000 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 21875-037 | |
| SAR-405 | ApexBio | A8883 | Inhibe la fosfoinositida 3-quinasa clase III (PIK3C3). Disolver en DMSO. |
| Silenciador Seleccione control negativo #1 (siCtrl) | ThermoFisher/Ambion | 4390843 | |
| Silenciador Seleccione siRNA dirigido a ATG9 (siATG9A) | ThermoFisher/Ambion | s35504 | |
| Silenciador Seleccione siRNA dirigido a FIP200 (siFIP200) | ThermoFisher/Ambion | s18995 | |
| Silenciador Seleccione siRNA dirigido a ULK1 (siULK1) | ThermoFisher/Ambion | s15964 | |
| Silenciador Seleccione siRNA dirigido a ULK2 (siULK2) | ThermoFisher/Ambion | s18705 | |
| Silenciador Seleccione siRNA dirigido a GABARAP (siGABARAP) | ThermoFisher/Ambion | s22362 | |
| Silenciador Seleccione siRNA dirigido a GABARAPL1 (siGABARAPL1) | ThermoFisher/Ambion | s24333 | |
| Silenciador Seleccione siRNA dirigido a GABARAPL2 (siGABARAPL2) | ThermoFisher/Ambion | s22387 | |
| Fosfato de sodio monobásico dihidratado (NaH2PO4 • 2H2O) | Merck-Millipore | 1.06580.1000 | |
| Fosfato de sodio dibásico dihidratado (Na2HPO4 • 2H2O ) | Prolabo | 28014.291 | |
| Sacarosa | VWR | 443816T | 10% concentración final en agua; filtrar a través de 0.45 µ m filtrar y conservar en la nevera durante meses |
| Thapsigargin | Sigma-Aldrich | T9033 | inhibe la bomba SERCA ER Ca2+. Disolver en DMSO. |
| Tritón X-405 | Sigma-Aldrich | X405 | 1% final |
| Tinción de azul de tripán 0,4% | Sondas moleculares | T10282 | |
| Tripsina-EDTA (0,25% con tripsina) | Gibco | 25200-056 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P2287 | 0,01% final |
Referencias
- Rubinsztein, D. C., Frake, R. A. Yoshinori Ohsumi's Nobel Prize for mechanisms of autophagy: from basic yeast biology to therapeutic potential. J R Coll Physicians Edinb. 46 (4), 228-233 (2016).
- Mizushima, N.
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Reimpresiones y permisos
