Un sondeo de la fuerza directa para medir la integración mecánica entre el núcleo y el citoesqueleto

Resumen

En este protocolo, se describe un método de la micropipeta para aplicar directamente una fuerza controlada al núcleo en una célula viva. Este ensayo permite interrogatorio de nucleares propiedades mecánicas en la célula viva, adherente.

Resumen

Las propiedades mecánicas del núcleo determinan su respuesta a fuerzas mecánicas generadas en las células. Porque el núcleo es molecularmente continuo con el citoesqueleto, se necesitan métodos para sondear su comportamiento mecánico en las células adherentes. Aquí, discutimos la sonda fuerza directa (DFP) como una herramienta para aplicar la fuerza directamente al núcleo en una célula adherente de viva. Atribuimos una micropipeta estrecha a la superficie nuclear con la succión. La micropipeta es traducida fuera del núcleo, que hace que el núcleo se deforman y traducir. Cuando la fuerza restauradora es igual a la fuerza de succión, el núcleo se separa y elásticamente se relaja. Porque precisamente se conoce la presión de succión, se conoce la fuerza en la superficie nuclear. Este método ha revelado que las fuerzas de la nano-escala son suficientes para deformar y traducir el núcleo de las células adherentes e identificaron elementos citoesqueléticos que permiten el núcleo resistir las fuerzas. El DFP puede utilizarse para analizar las contribuciones de los componentes celulares y nucleares para propiedades mecánicas nucleares en las células vivas.

Introducción

Patologías como el cáncer implican alteraciones nuclear forma y estructura^1,2, que generalmente están acompañados por una descalcificación de los núcleo^3,4. Nuclear resistencia a la deformación mecánica se ha caracterizado generalmente por aplicación de una fuerza en núcleos aislados⁵.

El núcleo en las células está conectado molecularmente con el citoesqueleto por el vinculador del nucleoesqueleto y citoesqueleto (LINC) complejo^6,7,....

Protocolo

1. preparar las células para la proyección de imagen

Nota: La punta de prueba de fuerza directa (DFP) se puede utilizar para cualquier tipo de células adherentes. Aquí, fibroblastos de ratón 3T3 NIH se utilizan como la línea celular de modelo para este protocolo.

1. Células de fibroblastos 3T3 NIH la cultura en el medio modificado Eagle de Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% suero bovino de donante y 1% de penicilina-estreptomicina en un fondo de cristal de 35 mm plato hasta confluencia deseada. Mantener las células a 37 ° C y 5% CO₂.
   1. Asegúrese de cubrir todos platos de fondo de cristal de 35 mm con 5 μg/mL de fib....

Resultados

Figura 2A muestra el forzamiento de un núcleo de fibroblasto de ratón NIH 3T3. Como la punta de la micropipeta es traducida a la derecha, el núcleo se deforma y finalmente se separa de la punta de la micropipeta. La tensión de la longitud del núcleo se considera que aumentan con el aumento de fuerza de la succión (figura 2B). El borde delantero del núcleo (micropipeta tirando borde) forma una protuberancia nuclear y el borde de f.......

Discusión

Medición de la integración mecánica del núcleo con el citoesqueleto es un reto para métodos más actuales, como la micropipeta aspiración¹⁶, porque requieren cualquiera de los dos núcleos aislados (donde el núcleo es desacoplado de citoesqueleto) o núcleos en células suspendidas (donde están ausentes las fuerzas extracelulares, tales como las fuerzas de tracción,). Fuerza se ha aplicado al núcleo mediante la aplicación de tensión biaxial a adherente de las células a una membrana^17.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
FluoroDish	WPI	FD35
SYTO 59	ThermoFisher Scientific	S11341
Femtotips	Eppendorf	930000043
InjectMan NI2	Eppendorf	NA	descatalogado, modelo equivalente actual: InjectMan 4
FemtoJet	Eppendorf	NA	Modelo actual FemtoJet 4i
Plan Inmersión en aceite Flúor 40x	Nikon	NA
Inmersión en aceite Apo TIRF 60x	Nikon	NA
Donor Bovine Serum (DBS)	ThermoFisher Scientific	16030074	NIH 3T3 suero
Dulbecco's Modification of Eagle's (DMEM)	Mediatech cellgro	MT10013CVRF	NIH 3T3
medium Penicilina-Estreptomicina	Mediatech	MT30004CIRF	NIH 3T3 suplemento medio Aceite
de inmersión Tipo LDF No fluorescente	Nikon	77007	Aceite de inmersión para lente de objetivo