Una medida de la cromatografía líquida de alto rendimiento de quinurenina y ácido quinurénico: relacionados con la bioquímica cognición y sueño en ratas

Summary

Alteraciones en los metabolitos de quinurenina vía (KP) neuroactivos implicados en enfermedades psiquiátricas. Investigar los resultados funcionales de un alterado quinurenina vía metabolismo en vivo en los roedores puede ayudar a elucidar nuevos enfoques terapéuticos. El protocolo actual combina enfoques bioquímicos y de comportamiento para investigar el impacto de un desafío de quinurenina aguda en ratas.

Abstract

La vía de la quinurenina (KP) de la degradación de triptófano ha sido implicada en trastornos psiquiátricos. Específicamente, el metabolito derivado de astrositos ácido quinurénico (KYNA), un antagonista en ambos N-metil-d-aspartato (NMDA) y α7 los receptores nicotínicos de la acetilcolina (α7nACh), se ha implicado en procesos cognitivos en la salud y la enfermedad. Como los niveles KYNA son elevados en los cerebros de pacientes con esquizofrenia, un mal funcionamiento en los receptores colinérgicos y glutamatérgicos se cree que la causal se relaciona con disfunción cognitiva, un dominio de base de la psicopatología de la enfermedad. KYNA puede jugar un papel patofisiológico importante en individuos con esquizofrenia. Es posible elevar el KYNA endógena en el cerebro de roedor por tratar a los animales con la quinurenina bioprecursor directa y estudios preclínicos en ratas han demostrado que elevaciones agudas en KYNA pueden afectar sus procesos de aprendizaje y la memoria. El protocolo actual describe este acercamiento experimental en detalle y combina a) un análisis bioquímico del nivel de quinurenina y cerebro formación KYNA (utilizando cromatografía líquida de alto rendimiento), b) comportamiento de prueba para probar la memoria contextual dependiente de hipocampo (paradigma de evitación pasiva) y c) una evaluación de comportamiento de sueño y vigilia [grabaciones telemétricas combinar señales de electromiografía (EMG) y Electroencefalografía (EEG)] en ratas. Tomados en conjunto, se estudia una relación entre el elevado KYNA, sueño y cognición, y este protocolo describe en detalle un enfoque experimental para comprender los resultados de la función de elevación de la quinurenina y KYNA formación en vivo en ratas. Resultados obtenidos a través de las variaciones de este protocolo pondrá a prueba la hipótesis que el KP y KYNA sirven papeles fundamentales en la modulación de sueño y cognición en Estados de salud y enfermedad.

Introduction

El KP es responsable de degradar casi el 95% del aminoácido esencial triptófano¹. En el cerebro mamífero, quinurenina en los astrocitos se metaboliza en la molécula pequeña neuroactivos KYNA principalmente por la enzima aminotransferasa (KAT) quinurenina II². KYNA actúa como un antagonista en los receptores NMDA y α7nACh en el cerebro^2,3,4, y también objetivos de señalización como el receptor de hidrocarburo de arilo (AHR) y la proteína G de receptores juntados receptor 35 (GPR35)^{5 ,}

Protocol

Los protocolos experimentales fueron aprobados por el Comité de uso y cuidado Animal institucional de la Universidad de Maryland y siguieron a guía los institutos nacionales de salud para el cuidado y uso de animales de laboratorio.

Nota: Se utilizaron ratas de Wistar macho adulto (250-350 g) en todos los experimentos. Distintas cohortes de animales fueron utilizados para el análisis bioquímico, experimentos conductuales y grabaciones de sueño-vigilia. Los animales fueron alojados en un centro de control de temperatura en el centro de investigación de Maryland psiquiátrico. Se mantuvieron en un ciclo de luz-oscuridad de 12/12 h, con luces m....

Results

Para validar el uso de una inyección intraperitoneal de quinurenina como método para elevar el cerebro KYNA, se realizó un análisis HPLC de tejido. Curvas estándar (figura 1) fueron construidas usando el software asociado y permite la cuantificación de las muestras de tejido. Cromatogramas representativos de quinurenina y KYNA se presentan en la figura 2. Quinurenina se observó en un tiempo de retención de 6 min y KYNA tenía un t.......

Discussion

Para una evaluación confiable de KYNA en el cerebro después de una administración periférica de la quinurenina, es fundamental combinar e interpretar experimentos bioquímicos y funcionales. Aquí, presentamos un protocolo detallado que permite a los usuarios nuevos para establecer métodos eficaces para la medición de la quinurenina de plasma y el cerebro KYNA de ratas. La medición de la quinurenina en plasma confirma la inyección precisa y la medición del metabolito KYNA confirma la síntesis de novo en el cerebro.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ratas Wistar	Charles River Laboratories		macho adulto, 250-350 g
Sulfato de L-quinurenina	Sai Advantium
ReproSil-Pur C18 columna (4 mm x 150 mm)	Dr. Maisch GmbH
EZ Clips	Stoelting Co.	59022
Materiales de montaje tornillos	PlasticsOne	00-96 X 1/16
Suturas no absorbibles	MedRep Express	699B	CP Medical Monomid Black Nylon Suturas, 4-0, P-3, 18", CAJA de 12
Suturas Absorbibles	Ethicon	J310H	4-0 Coated Vicryl Violet 1X27'' SH-1
Dental Cement	Stoelting Co.	51458
Broca	Stoelting Co.	514551	0.45 mm
Name	Company	Número de catálogo	Comentarios
Alliance HPLC system
E2695 módulo de separación	Waters	176269503
detector de fluorescencia 2475	Waters
Administrador de reactivos posteriores a la columna	Waters	725000556
computadora Lenovo	Software 668000249
Empower	de Waters	176706100
Name	Company	Número de catálogo	Comentarios
>Caja de evitación pasiva para ratas
de MDF extra alto	MedAssociates	ENV-018MD	Interior: 22" (W) x 22" (H) x 16" (D)
caja de lanzadera moduladora de canal central	MedAssociates	ENV-010MC
Suelo de rejilla de acero inoxidable para ratas	MedAssociates	ENV-010MB-GF
Puerta de guillotina automática	MedAssociates	ENV-010B-S
Arnés de suelo de rejilla de desconexión rápida para ratas	MedAssociates	ENV-010MB-QD
Luz de estímulo, lente blanca de 1", montada en panel modular	MedAssociates	ENV-221M
Sonalert con control de volumen para cámara de ratas	MedAssociates	ENV-223AM
Paquete SmartCtrl de 8 entradas/16 salidas	MedAssociates	DIG-716P2
Control IR de 8 canales para cajas de lanzadera	MedAssociates	ENV-253C
Fuente infrarroja y tiras de matriz de detectores	MedAssociates	ENV-256
Gabinete de interfaz de sobremesa, 120 V 60 Hz	MedAssociates	SG-6080C
Módulo de estimulación aversiva de corriente constante de doble rango	MedAssociates	ENV-410B
Módulo codificador de suelo de rejilla de estado sólido	MedAssociates	ENV-412
Módulo de control de choque Dual A/B	MedAssociates	ENV-415
Extensión mini-molex de 2' y 3 pines	MedAssociates	SG-216A-2
Cable de salida de choque de 10', DB-9 M/F	MedAssociates	SG-219G-10
Cable de control de choque de lanzadera 15', 6	MedAssociates	SG-219SA
Pequeño armario de sobremesa y fuente de alimentación, 120 V 60 Hz	MedAssociates	SG-6080D Paquete
interfaz PCI	MedAssociates	DIG-700P2-R2
Paquete utilitario para evitar la caja de lanzadera	MedAssociates	SOF-700RA-7
Name	< strong>Company	Número de catálogo	Comments
Equipo de monitoreo de sueño-vigilia
Ponehmah software	Data Sciences International (DSI)	PNP-P3P-610
MX2 8 Interfaz de adquisición de fuentes	Data Sciences International (DSI)	PNM-P3P-MX204
Computadora Dell, Optiplex 7020, Windows 7, 64 bits	Data Sciences International (DSI)	271-0112-013
Monitor de computadora Dell de 19"	Data Sciences International (DSI)	271-0113-001
Receptores para jaulas de plástico, 8x	Data Sciences International (DSI)	272-6001-001
Cisco RV130 VPN router Data	Sciences International (DSI)	RV130
Matrix 2.0	Data Sciences International (DSI)	271-0119-001
Conmutador de red	Data Sciences International (DSI)	SG200-08P
Software Neuroscore	Data Sciences International (DSI)	271-0171-CFG
Transmisor de dos canales biopotenciales, modelo TL11M2-F40-EET	Data Sciences International (DSI)	270-0134-001