Un método de cultura Proximal para el estudio de señalización paracrina entre células

Summary

Paracrina y yuxtacrina interacciones celulares juegan un papel importante en muchos procesos biológicos, incluyendo la progresión del tumor, respuesta inmune, angiogénesis y desarrollo. Aquí, un método de cultura proximal se utiliza para el estudio de señalización paracrina donde se mantienen las concentraciones localizadas de los factores secretados evitando contacto celular directo.

Abstract

Interacciones intercelulares juegan un papel importante en muchos procesos biológicos, incluyendo la progresión del tumor, respuesta inmune, angiogénesis y desarrollo. Paracrina o señalización yuxtacrina interviene en tales interacciones. El uso de un medio condicionado y cocultivo estudios son los métodos más comunes para discriminar entre estos dos tipos de interacciones. Sin embargo, el efecto de las altas concentraciones localizadas de factores secretados en el microambiente durante las interacciones paracrinas no es exactamente recapitulado por medio condicionado y, por lo tanto, puede conducir a conclusiones imprecisas. Para superar este problema, hemos ideado un método de cultivo próximo para estudiar la señalización paracrina. Los dos tipos celulares son cultivados en cualquier superficie de una membrana de policarbonato de espesor μm 10 con 0,4 μm poros. Los poros permiten el intercambio de factores secretados y, al mismo tiempo, inhiben la señalización yuxtacrina. Las células pueden ser recogidas y lisis en el criterio de valoración para determinar los efectos de la señalización paracrina. Además de permitir para gradientes de concentración localizados de factores secretados, este método es sensible a los experimentos que implican largos períodos de la cultura, así como el uso de inhibidores. Mientras que utilizamos este método para estudiar las interacciones entre las células de cáncer de ovario y las células mesoteliales que se encuentran en el sitio de metástasis, puede ser adaptado a cualquier dos tipos de células adherentes a los investigadores estudiar paracrina señalización en varios campos, incluyendo el desarrollo, Inmunología y microambiente tumoral.

Introduction

El papel de productivas interacciones recíprocas entre células cancerosas y el microambiente tumoral en la progresión tumoral ha sido bien establecido y se ha convertido en un importante foco de investigación en cáncer biología¹. Casos similares de señalización bidireccional son cruciales durante la cicatrización, respuesta inmune, angiogénesis, nichos de células madre y en desarrollo^{2,3,4,5,6 , 7 , 8}. un tema comú....

Protocol

El protocolo sigue las pautas de la institucional Consejo Regulador de la Universidad de Indiana.

1. preparación de la célula

1. Aislamiento y cultivo de células mesothelial primarias humanas
   1. Aislamiento primarias mesothelial células humanas (HPMCs) del epiplón humano como se ha descrito anteriormente^17,18 y cultivarlas en completan medio [modificado Eagle de Dulbecco Medium (DMEM) que contiene 10% suero fetal bovino, 1% penicilina-estreptomicina, los de aminoácidos no esenciales 1% y 1% vitaminas] en 37 ° C y 5% CO₂.
      Nota: El HPMCs t....

Results

Extenderse por metástasis de las células de cáncer de ovario encuentran células mesoteliales en el sitio de la metástasis en la cavidad peritoneal¹⁹. Interacciones paracrinas y yuxtacrina productivas con la ayuda de células mesoteliales en la inducción de respuestas adaptativas en las células de cáncer de ovario, que permiten la metástasis exitosa^17,18,20,

Discussion

Entender el mecanismo de paracrina, yuxtacrina señalización entre las células es esencial para el desarrollo de un mejor conocimiento del tejido normal homeostasis y enfermedad condiciones^7,8. Paracrina la mayoría señalización estudios se llevan a cabo recogiendo acondicionado medio de una célula tipo y usarlo para tratar a otro tipo de célula. Este método tiene una ventaja en su simplicidad inherente. Sin embargo, no precisa recapitular las concentraciones local.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Soporte permeable Transwell de 24 mm con 0,4 y micro; m Inserto de membrana de policarbonato para poros	Corning (Costar)	3412	• 10 µ membrana de policarbonato translúcido de m de espesor • Tratamiento para una fijación óptima de las células • Empaquetado 6 insertos en una placa de 6 pocillos, 4 placas por caja • La membrana debe teñirse para la visibilidad de la célula • Esterilizado por radiación gamma
placa de 6 pocillos	Corning (Falcon)	353046	Fondo plano, tratado con TC, estéril, con tapa
Placa de cultivo de 15 cm	Corning (Falcon)	353025	Placa de cultivo celular estéril tratada con TC
DMEM	Corning (Cellgro)	10-013-CV
Penicilina Estreptomicina	Corning	30-002-CI
MEM Amino no esencial ácidos	Corning (Cellgro)	25-025-CI
MEM Vitaminas	Corning (Cellgro)	25-020-CI
0,25% Tripsina, 2,21 mM EDTA	Corning	25-053-CI
Suero fetal bovino	Atlanta Biologicals	S11150
Pipets			Cualquier marca está bien
Incubadora			Cualquier marca está bien
		de bioseguridad de nivel II	Cualquier marca está bien
Ensayo de expresión génica FN1 TaqMan	ThermoFisher Scientific	Hs01549976_m1
TGFB1 Ensayo de expresión génica TaqMan	ThermoFisher Scientific	Hs00998133_m1
CDH1 Ensayo de expresión génica TaqMan	ThermoFisher Scientific	Hs01023895_m1
GAPDH Expresión génica TaqMan Ensayo	ThermoFisher Scientific	Hs99999905_m1
miRNeasy mini kit de aislamiento de ARN	Qiagen	217004
kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad	ThermoFisher Scientific	43-688-13
Células de cáncer de ovario HeyA8	Obtenido del Laboratorio de Ernst Lengyel, Universidad de Chicago
TGFβ Anticuerpo neutralizante	R& Sistemas D	MAB1835-100