Implante de janela de laminectomia e medula espinhal no mouse
Summary
Este protocolo descreve a implantação de uma janela de vidro na medula espinal de um rato para facilitar o visualização pela microscopia intravital.
Abstract
Este protocolo descreve um método para o laminectomy da medula espinal e a implantação da janela de vidro para in vivo Imaging da medula espinal do rato. Um vaporizador digital integrado é utilizado para alcançar um plano estável de anestesia a uma taxa de baixo fluxo de isoflurano. Uma única espinha vertebral é removida, e um tampa-vidro comercialmente disponível é sobreposto em uma cama fina do agarose. Um backplate plástico 3D-Printed é afixado então às espinhas vertebrais adjacentes usando o adesivo do tecido e o cimento dental. Uma plataforma de estabilização é usada para reduzir o artefato de movimento da respiração e do batimento cardíaco. Este método rápido e braçadeira-livre é poço-serido para a microscopia de fluorescência aguda do multi-fóton. Os dados representativos são incluídos para uma aplicação desta técnica à microscopia do dois-fotão da vasculatura da medula espinal em ratos transgênicas que expressam EGFP: Claudin-5 — uma proteína apertada da junção.
Introduction
Modelos animais transgênicos expressando proteínas fluorescentes, quando combinados com microscopia intravital, proporcionam uma plataforma poderosa para abordar a biologia e a fisiopatologia. Para aplicar estas técnicas à medula espinal, os protocolos especializados são exigidos para preparar a medula espinal para a imagem latente. Uma tal estratégia é conduzir um implante da janela do laminectomy e da medula espinal. As características chaves de um protocolo ideal do laminectomy para a microscopia incluem a preservação da estrutura e da função nativas do tecido, a estabilidade do campo da imagem latente, o tempo de processamento rápido, e a reprodutibilidade dos resultados. Um desafio particular é estabilizar o campo de imagem contra o movimento induzido pela respiração e batimento cardíaco. Várias estratégias ex vivo e in vivo têm sido relatadas para atingir esses objetivos1,2,3,4,5. A maioria dos métodos in vivo envolve o aperto dos lados dacoluna vertebral2,4e é freqüentemente seguido pelaimplantação de um aparelho metálico rígido3,4para estabilidade durante a cirurgia e aplicações de imagem a jusante. Apertar a coluna vertebral pode potencialmente comprometer o fluxo sanguíneo e induzir a remodelação da proteína da barreira hematoencefálica (BBB).
A finalidade deste método é fazer a medula espinal intacta disponível para a imagem latente ótica no rato vivo ao minimizar a invasividade do protocolo e de melhorar resultados. Nós descrevemos um único procedimento do implante do laminectomy e da tampa-vidro emparelhado com um backplate 3D-impresso plástico oval minimamente invasor que ainda consiga a estabilidade mecânica robusta. A placa traseira é diretamente aderida às espinhas vertebrais anterior e posterior com cimento dentário. O backplate é equipado com os braços laterais da extensão com os furos do parafuso que fixam rigidamente ao estágio do microscópio através de um braço do metal. Isto Ancora eficazmente a vértebra anterior e posterior intacta ao estágio do microscópio, fornecendo a resistência mecânica ao artefato do movimento que seria introduzido de outra maneira pela respiração e pelo batimento cardíaco. O método foi otimizado para laminectomia de uma única vértebra no nível torácico 12, omitindo as braçadeiras utilizadas em estratégias alternativas de estabilidade durante a imagiologia in vivo . O procedimento é rápido, levando aproximadamente 30 min por mouse.
Este protocolo pode ser usado para estudar os mecanismos da doença do BBB. O BBB é um sistema microvascular dinâmico composto por células endoteliais, músculo liso vascular, pericytes e processos de pé astrocícito que proporcionam um ambiente altamente seletivo para o sistema nervoso central (SNC). Os dados representativos descrevem a aplicação deste protocolo em camundongos transgênicos projetados para expressar proteína verde fluorescente reforçada (eGFP): Claudin-5, uma proteína de junção apertada BBB. Os arquivos de impressão de backplate fornecidos também podem ser personalizados para aplicativos alternativos.
Protocol
Representative Results
Discussion
O método descrito aqui permite a imagem latente estável da medula espinal nos ratos através de uma janela de vidro. Este método foi aplicado para avaliar o remodelamento de BBB no EGFP transgênicas: Claudin5 +/-camundongos que expressam uma proteína de junção apertada fluorescente de BBB, mas poderia ser aplicada ingualmente bem para estudos de todas as proteínas ou pilhas fluorescentes na medula espinal.
Os métodos múltiplos para a estabilização do laminectomy e da medula espinal…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
S.E. Lutz é apoiado pelo centro nacional para o avanço das Ciências translacionais, institutos nacionais de saúde, Grant KL2TR002002 e da Universidade de Illinois Chicago College of Medicine start-up fundos. Simon Alford é apoiado por RO1 MH084874. O conteúdo é unicamente da responsabilidade dos autores e não representa necessariamente os pontos de vista oficiais da NIH. Os autores agradecem Dritan Agalliu no departamento de Neurologia do centro médico da Universidade de Columbia para o TG eGFP: Claudin-5 camundongos, discussões científicas, e insights sobre o desenvolvimento do protocolo cirúrgico e aplicações de imagem. Os autores agradecem a Sunil P. Gandhi no departamento de neurobiologia e comportamento da Universidade da Califórnia, Irvine para projetar o primeiro protótipo do aparelho estereotáxica e controlador de temperatura animal, discussão do protocolo cirúrgico, e formação em microscopia de dois fótons. Os autores também agradecem Steve Pickens (W. Nuhsbaum, Inc.) para o auxílio na personalização do estereomicroscópio cirúrgico, e Ron Lipinski (Whale Manufacturing) para usinagem de peças estereotáticas.
Materials
| 3D printer | Raise3D | Pro2 | For printing backplates |
| PLA 3D printing filament | Inland | PLA+-175-B | Black plastic 3D printing material |
| 3D CAD software | Dassault Systemes | Solidworks software | used to design 3D shapes |
| 3D printer software | Raise3D | Ideamaker software | software used to interface with the 3D printer |
| 3D printed oval backplate | custom | Stabilizing imaging field | |
| Surgical dissecting microscope | Leica | M205 C | Equipped with Leica FusionOptics, Planapo 0.63x M-series objective, and gliding stage |
| Microscope camera | Leica | MC170 | HD color camera for visualizing surgical field |
| Gliding stage | Leica | 10446301 | The gliding stage is constructed of two metal plates. The base plate is fixed. The upper plate slides on greased interface to allow rotational and linear movement. |
| Surgical station and stabilization fork | Whale Manufactoring | custom | Laminectomy |
| SomnoSuite low-flow isoflurane delivery unit | Kent Scientific | SS-01 | Surgical anesthesia administration with integrated digitial vaporizer |
| Stainless steel 1.5 inch mounting post | ThorLabs | P50/M | For mounting surgical station onto optical table for two-photon imaging |
| Counterbored Clamping Fork for 1.5" mounting Post | ThorLabs | PF175 | For stabilizing surgical station mount onto optical table for two-photon imaging |
| Ideal bone microdrill | Harvard apparatus | 72-6065 | Thinning bone for laminectomy |
| Water bath | Fisher Scientific | 15-462-10 | Warming saline |
| Cautery gun | FST | 18010-00 | Cauterizing minor bleeds |
| Heating pad | Benchmark | BF11222 | 1.9” x 4.5” silicone heater with 20” Teflon leads, 10W, 5V |
| K type thermocoupled rectal probe | Physitemp | RET3 | Measuring mouse body temperature |
| petroleum jelly | Sigma | 8009-03-8 | Lubricating rectal probe |
| Feedback-regulated thermal controller | custom | NA | Commercially available alternatives include the Physitemp TCAT series |
| PVA Surgical eye spears | Beaver-visitec international | 40400-8 | Absorbing blood |
| Electric trimmer | Wahl | 41590-0438 | Trimming mouse fur |
| Blade, #11 | FST | 14002-14 | Surgical tool |
| Forceps, #5 | FST | 11254-20 | Surgical tool |
| Forceps, #4 | FST | 14002-14 | Surgical tool |
| Titatnium toothed forceps | WPI | 555047FT | Surgical tool |
| Titanium Iris scissors | WPI | 555562S | Surgical tool |
| Vetbond tissue adhesive | 3M | 084-1469SB | Preparing tissue surface for dental acrylic |
| Ceramic mixing tray | Jack Richeson | 420716 | Mixing dental acrylic agent with accelerant |
| Orthojet dental acrylic | Lang Dental | 1520BLK, 1503BLK | Permanently bonding backplate to tissue |
| Small round cover glass, #1 thickness, 3 mm | Harvard apparatus | 64-0720 | optical window |
| NaCl | Fisher Scientific | 7647-14-5 | For aCSF |
| KCl | Fisher Scientific | 7447-40-7 | For aCSF |
| Glucose | Fisher Scientific | 50-99-7 | For aCSF |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | For aCSF |
| MgCl2·6H2O | Fisher Scientific | 7791-18-6 | For aCSF |
| CaCl2·2H2O | Fisher Scientific | 10035-04-8 | For aCSF |
| Carprofen | Rimadyl | QM01AE91 | Analgesia |
| Bacteriostatic water | Henry Schein | 2587428 | Diluent for carprofen |
| Isoflurane | Henry Schein | 11695-6776-2 | Anesthesia |
| Lactated ringer solution | Baxter | 0338-0117-04 | Hydration for mouse |
| Agarose High EEO | Sigma | A9793 | gel point 34-37 degrees C |
| Opthalmic lubricating ointment | Akwa Tears | 68788-0697 | Prevent corneal drying |
| MOM Two-Photon Microscope | Sutter |
Referencias
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