Análisis de los complejos de la proteína de membrana de tilacoides por electroforesis nativa azul

Resumen

Un protocolo para la aclaración de planta tilacoides proteína compleja organización y composición con poliacrilamida nativa azul gel electroforesis (BN-PAGE) y 2D-SDS-PAGE se describe. El protocolo está optimizado para Arabidopsis thaliana, , pero puede ser utilizado para otras especies de plantas con modificaciones menores.

Resumen

Cadena de transferencia de electrones fotosintética (ETC) convierte energía solar en energía química en forma de NADPH y ATP. Cuatro grandes complejos integrados en la energía solar de la cosecha la membrana del thylakoid para conducir electrones del agua al NADP⁺ a través de dos fotosistemas y el gradiente del protón creada para la producción de ATP. Photosystem PSII, PSI, citocromo b₆f (Cyt b₆f) y ATPasa son todos los complejos de multiproteínas con distinta orientación y dinámica de la membrana del thylakoid. Puede obtenerse información valiosa sobre la composición e interacciones de los complejos de proteína en la membrana del thylakoid solubilizando los complejos de la integridad de la membrana por detergentes suaves, seguidos por separación electroforética gel nativo de la complejos. Electroforesis en gel de poliacrilamida nativo azul (BN-PAGE) es un método analítico utilizado para la separación de complejos de proteína en su forma nativa y funcional. El método puede ser utilizado para la purificación de complejos de proteínas para análisis estructural más detallado, pero también proporciona una herramienta para analizar las interacciones dinámicas entre los complejos de proteína. El método fue desarrollado para el análisis de los complejos respiratorios mitocondriales, pero desde entonces ha optimizado y mejorado para la disección de los complejos de proteína de tilacoides. Presentamos un protocolo actualizado detallado para el análisis de los complejos fotosintéticos lábil y sus interacciones en Arabidopsis thaliana.

Introducción

Grande multisubunit proteína complejos fotosistema PSI y PSII, Cyt b₆f y ATPasa coordinan la producción de NADPH y de ATP en las reacciones de luz fotosintéticas. En cloroplastos de plantas superiores, los complejos se encuentran en la membrana del thylakoid, que es una estructura de membrana estructuralmente heterogéneo, compuesto por Appresso grana y tilacoides de estroma no appressed. Electroforesis en gel de poliacrilamida nativo azul (BN-PAGE) es un método ampliamente utilizado en el análisis de complejos de grande multisubunit proteína en su forma natural y biológicamente activo. El método se estableció para la disección de la membrana mitocondrial pr....

Protocolo

1. preparación de BN Gel^1,2,3

1. Configurar la rueda de gel con las placas de 8 x 10 cm (rectangular de vidrio y placa de alúmina con muescas) según instrucciones del fabricante utilizando a espaciadores de 0,75 mm.
2. Poner un mezclador de gradiente sobre una placa de agitación y conectar con la bomba peristáltica por una tubería. Coloque una aguja de jeringa en el otro extremo de la tubería y colocar la aguja entre la placa de vidrio y aluminio. Agitador magnético de lugar a la "pesada" (H)-cámara.
3. Preparar el 3,5% (....

Resultados

Un sistema representativo de 2D-BN/SDS-PAGE en la figura 1 muestra la separación de digitonin y complejos de la proteína β-DM-solubilizado tilacoides y su composición de la subunidad de proteína detallada. El patrón complejo de proteína de digitonin solubilizado tilacoides (gel horizontal en la parte superior la parte superior de la figura 1A) contiene el PSII-LHCII-PSI megacomplex, dos grandes supercomplexes de PSII-LHCII (sc), .......

Discusión

El mecanismo de conversión de energía fotosintética está compuesto por complejos de grande multisubunit proteína, que se incrustan en la membrana de los tilacoides. Este protocolo describe un método básico para el análisis de los complejos de proteína de tilacoides plantas de Arabidopsis thaliana con BN-PAGE junto con 2D-SDS-PAGE. El protocolo también es adecuado para el análisis de los complejos de la proteína del thylakoid de tilacoides tabaco y espinacas, pero puede necesitar pequeños retoques.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Ácido 6-aminocaproico (ACA)	Sigma-Aldrich	A2504
BisTris	Sigma-Aldrich	B4429
Sacarosa	Sigma-Aldrich	S0389
Acrilamida (AA)	Sigma-Aldrich	A9099	Precaución: ¡Neurotóxico!
n-dodecilo-β-D-maltósido	Sigma-Aldrich	D4641
Tricine	Sigma-Aldrich	T0377
Tris	Sigma-Aldrich	T1503
SDS	VWR	442444H
Urea	VWR	28877.292
Glicerol	J.T. Baker	7044
Fluoruro de sodio (NaF)	J.T. Baker	3688
EDTA sal disódica	J.T. Baker	1073
Digitonin	Calbiochem	300410	Precaución:¡Tóxico!
Pefabloc SC	Roche	11585916001
Serva Coomassie Blue	G Serva	35050
β-mercaptoetanol	Bio-Rad	1610710
APS (Persulfato de amonio)	Bio-Rad	161-0700
TEMED (Tetrametiletilendiamina)	Bio-Rad	1610801
(N,N'-Metileno)-Bis-Acrilamida	Omnipur	2610
Glycine	Fisher	G0800
Marcador de proteínas preteñido, amplio rango (7-175 kDa)	New England Biolabs	P7708
Falcon, tubos de centrífuga cónicos 15 ml	Corning	352093
Doble rueda de gel con placas de 10 x 8 cm	Hoefer	SE215
Máquina de degradado SG5	Hoefer
Espaciadores en T de 0,75 mm	Hoefer	SE2119T-2-.75
Peine de gel de muestra, 0,75 mm	Hoefer	SE211A-10-.75
Mighty Small Sistema de electroforesis vertical SE250	Bomba IPC Hoefer	SE250
Fuente de	Ismatec
, centrífuga PowerPac HV	Bio-Rad	164-5097
	Eppendorf	5424R Rocker-Shaker
	Biosan	BS-010130-AAI
br/> PROTEAN II xi Cell	Bio-Rad	1651813

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