Inhibición de la proteína inducible y Reversible dominante negativo (DN)

Resumen

Aquí presentamos un protocolo para desarrollar un sistema inducible negativo dominante, en el que cualquier proteína puede ser condicional inactivada por overexpressing reversiblemente una versión mutante dominante negativo de él.

Resumen

Dominante negativa inhibición de la proteína (DN) es un método potente para manipular la función de la proteína y ofrece varias ventajas sobre otros enfoques basados en el genoma. Por ejemplo, aunque quimérica y Cre-LoxP estrategias objetivos han sido ampliamente utilizados, las limitaciones intrínsecas de estas estrategias (es decir, actividad de promotor agujereado, expresión del Cre de mosaico, etc.) han restringido significativamente su aplicación. Por otra parte, una canceladura completa de numerosos genes endógenos es catequizador letal, lo que hace imposible para el estudio de funciones de los genes en la vida postnatal. Para enfrentar estos desafíos, hemos hecho cambios significativos a un protocolo de ingeniería genética temprana y combina una versión corta (transgénica) del gen Rb1 con una proteasa lysosomal B procathepsin (CB), para generar un modelo de ratón de DN de Rb1 (CBRb). Debido a la presencia de una proteasa lisosomal, la proteína de la fusión completa de CB-RB1 y su complejo de interacción se dirigen para la degradación mediada por el proteasoma. Por otra parte, la presencia de un elemento inductor (rtTA) de tetraciclina en la construcción de transgénico permite una regulación inducible y reversible de la proteína de RB1. La presencia de un promotor de ROSA-CAG omnipresente en el modelo de ratón de CBRb es una herramienta útil para realizar ablación de gene Rb1 transitoria y reversible y proporcionar a los investigadores un recurso para comprender su actividad en prácticamente cualquier tipo de célula donde se expresa el RB1.

Introducción

Enfoques más con el objetivo de la ablación del gen y la proteína dependen de procesos permanentes, que generalmente conducen a la eliminación completa o el truncamiento de la gene, secuencias de ARN o proteínas de interés (POI). El objetivo general de este método es diseñar una proteína recombinante para suprimir la función de la proteína endógena, tipo salvaje. Hemos revisado y renovado una estrategia alternativa^1,2, que permite la ablación temporal de un POI a través de la inhibición de la DN. Este método funciona para multiméricas y péptidos monoméricos pero es el más adecuado para las proteínas que funcio....

Protocolo

Generación de todo cuidado de los animales en el ratón transgénico de CBRb y experimentos relacionados con el estudio fueron aprobados por el cuidado de Animal institucional de Universidad de Creighton y el Comité uso (IACUC) y realizadas por sus orientaciones.

1. transgénicos CB-Myc₆-construcción de Rb1

Nota: La clonación de CBRb en un vector de pTet_Splice fue hecha en un proceso de múltiples paso (figura 1A y 1B).

1. Llevar a cabo la primera clonación de etapa en la pCS2 + CB-Myc6 vector.
   1. Para crear la....

Resultados

En general, diseñar una mutación DN requiere una cantidad considerable de información sobre la estructura y función de la PDI. En contraste, la estrategia de DN presentada aquí es particularmente útil cuando la información estructural y funcional para el POI es limitada. Si el POI es una proteína multimérica, una fusión de una subunidad a una proteasa lysosomal dominante puede inhibir multimer montado y, potencialmente, otros ligandos a través de una combinación de la proteólisis de las s.......

Discusión

Para eludir las limitaciones asociadas con las estrategias tradicionales de transgénicas, se buscó generar un modelo de ratón en el que un POI endógena puede ser condicional inactivado por overexpressing una forma mutante de DN de él de manera espacio-temporal. Para suprimir la función de POIs endógenos, varias opciones han sido propuestos^15,16,17. Hemos modificado una estrategia genética anterior¹ combin.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Dulbecco's Modified Eagle's Medium, DMEM	GIBCO-BRL	11965-084
Minimum Essential Medium Eagle, MEME	Sigma	M8042
Suero fetal bovino	Sigma	F2442
Lipofectamina	DharmaFECT	T-2010-03
Sal I	Roche	11745622
EcoRV-HF	New England BioLabs	R3195S
NotI	Roche	13090730
CaspaTag	Millipore	APT523
DAPI	Sigma	D9542
Staurosporine	Sigma	S4400
CyQuant NF	Invitrogen	C35007
Retinoblastoma 1 anticuerpo	Abcam	Ab6075
c-Myc anticuerpo	Sigma	M5546
b-actina	Sigma	A5316
Ki-67	Thermofisher scientific	MA5-14520
Phallodin	Thermofisher scientific	A12379
Lector de microplacas de fluorescencia	FLUOstar OPTIMA, BMG Labtech
Microscopio de epifluorescencia	NikonEclipse80i
La línea de ratones TetO-DN-CB-myc6-Rb1 (DN-CBRb) está disponible en el Laboratorio Jackson como JAX#032011.

Kit de proliferación celular