Summary

Protoplasts를 사용 하 여 엽록체로 공부 단백질 가져오기

Published: December 10, 2018
doi:

Summary

여기는 못 중재 변환 메서드를 사용 하 여 protoplasts로 단백질을 표현 하는 프로토콜에 설명 합니다. 관심, 단백질 및 단백질 현지화 및 다양 한 실험 조건에 대 한 가져오기 프로세스의 효율적인 조사의 쉬운 표현 제공 합니다 vivo에서.

Abstract

엽록체는 식물, 광합성 등 많은 보조 metabolites의 지질 생산에에서 다양 한 세포질 과정을 담당 하는 필수적인 세포 기관이 이다. 엽록체는 이러한 다양 한 생리 적 과정에 대 한 단백질의 많은 수를 요구 한다. 이상의 엽록체 단백질의 95 %cytosolic 리보솜에서 번역 후 핵 인코딩되고는 cytosol에서 엽록체에 가져온 있습니다. 따라서, 적절 한 가져오기 또는 엽록체를이 핵 인코딩 엽록체 단백질의 엽록체 식물 세포의 적절 한 작동에 필수적입니다. 핵 인코딩 엽록체 단백질 포함 엽록체를 특정 대상에 대 한 신호 순서. 분자 기계는 엽록체 또는 cytosol로 이러한 신호를 인식 하 고 가져오기 프로세스를 수행. 단백질 가져오기 또는 vivo에서엽록체를 타겟팅의 메커니즘을 조사, 우리 신속 하 고 효율적인 원생 동물 기반 방법을 개발 애기의 엽록체로 단백질 수입 분석 하. 이 방법에서는, 우리 애기의 잎 조직에서 분리 된 protoplasts를 사용 합니다. 여기, 우리는 단백질 엽록체로 가져올 메커니즘을 조사 하기 위해 protoplasts를 사용 하 여 상세한 프로토콜을 제공 합니다.

Introduction

엽록체는 식물에서 가장 중요 한 세포 중 하나입니다. 엽록체의 주요 기능 중 하나는 광합성1수행입니다. 엽록체는 또한 지방산, 아미노산, 뉴클레오티드, 및 수많은 이차 대사 산물1,2의 생산에 대 한 많은 다른 생 화 확 적인 반응을 실시합니다. 모든이 반응은 엽록체 단백질의 다른 종류의 많은 수를 필요로합니다. 그러나, 엽록체 게놈에는 약 100만 유전자3,4포함 되어 있습니다. 따라서, 엽록체는 cytosol에서 그들의 단백질의 대부분을 가져와야 합니다. 사실, 대부분의 엽록체 단백질 번역4,,56후는 cytosol에서 가져올 수을 표시 했다. 식물 세포에는 엽록체에는 cytosol에서 단백질을 가져올 특정 메커니즘이 필요 합니다. 그러나, 이러한 단백질 가져오기 메커니즘 지난 몇 십년에 대 한 조사는, 비록 우리가 아직 이해 하지 않습니다 완전히 그들 분자 수준에서. 여기, 우리 protoplasts를 준비 하 고 protoplasts에 있는 유전자를 표현 하는 것에 대 한 자세한 방법을 제공 합니다. 이 메서드는 elucidating 자세히 엽록체로 단백질 가져오기 기본 분자 메커니즘에 대 한 중요 한 될 수 있습니다.

단백질 가져오기는 많은 다른 방법을 사용 하 여 공부 될 수 있다. 이러한 방법 중 하나는 생체 외에서 단백질 가져오기 시스템7,8의 사용을 포함. 체 외에서이 방법을 사용 하 여-번역 된 단백질 선구자는 순화 된 엽록체에 생체 외에서인 큐베이 팅 및 단백질 가져오기 SDS 페이지 뒤에 서쪽 오 점 분석에 의해 분석 된다. 이 방법의 장점은 엽록체로 단백질의 각 단계 세부에서 공부 될 수 있다입니다. 따라서,이 방법은 널리 사용 되었습니다 단백질 가져오기 분자 기계 구성 요소를 정의 하 고 교통 펩 티 드에 대 한 시퀀스 정보 부. 더 최근에, 잎 조직에서 protoplasts의 사용을 포함 하는 또 다른 방법은 개발 되었다 고 단백질 가져오기 엽록체9,10으로 공부를 널리 사용 되고있다. 이 방법의 장점은 그대로 세포의 생체 외에서 시스템 보다 가까이 세포 환경을 제공 하는 protoplasts. 따라서, 원생 동물 시스템 관련된 cytosolic 이벤트 등 어떻게 신호를 표적으로 하기의 특이성 결정은이 과정의 많은 추가 측면을 해결 수 있습니다. 여기, 우리는 단백질 가져오기 엽록체로 공부 하는 protoplasts의 사용에 대 한 자세한 프로토콜 제시.

Protocol

1입니다. 애기 식물의 성장 1 L Gamborg B5 준비 (B5) 매체 B5 매체의 3.2 g를 추가 하 여 비타민, 자당의 20 g, 2-(N-morpholino) 탄 술 폰 산 (MES), 이온을 제거 된 물 약 800 mL의 0.5 g과 수산화 칼륨 (KOH)와 5.7에 pH를 조정. 추가 더 이온된 물 phytoagar 고압 121 ° c.에 15 분의 1 나 추가 8 g 총 볼륨을가지고 55 ° C까지 냉각 및 깨끗 한 벤치에 페 트리 접시 (지름에서 9 c m, 높이 1.5 c m) B5 매체의 20-25 mL를 붓고…

Representative Results

엽록체에 단백질의 수입 두 가지 방법을 사용 하 여 시험 될 수 있다: SDS 페이지 중재 분리 후 형광 현미경 검사 법 및 immunoblot 분석. 여기, 우리는 Rbc 사용-nt:GFP, 융합 건설 Rbc GFP 융합 교통 펩 티 드를 포함 하는 79 N 맨끝 아미노산 잔류물을 인코딩. 대상 단백질 Rbc에서에서 녹색 형광 신호 단백질은 엽록체로 가져오면-형광 현미경 검사 법 (그림 1)에 ?…

Discussion

우리는 엽록체에 단백질 가져오기 공부 애기 의 protoplasts의 사용에 대 한 상세한 프로토콜을 제공 합니다. 이 메서드는 강력한 단백질 가져오기 프로세스를 조사. 이 간단 하 고 다재 다능 한 기술은 엽록체를 의도 화물 단백질을 대상으로 조사 하기 위한 유용 합니다. 이 메서드를 사용 하 여, protoplasts는 매우 일찍 완전히 성숙한 잎에서 배열 하는 많은 다른 성장 단계에서 식물에서 얻을 수…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작품 농업 과학 기술 개발 (프로젝트 번호에 대 한 협동 연구 프로그램의 지원으로 수행 되었다 PJ010953012018), 농촌 진흥청과 국립 연구 재단 (한국) 그랜트 과학기술부와 ICT (No. 2016R1E1A1A02922014), 한국.

Materials

GAMBORG B5 MEDIUM INCLUDING VITAMINS Duchefa Biochemie G0210.0050
SUCROSE Duchefa Biochemie S0809.5000
MES MONOHYDRATE Duchefa Biochemie M1503.0250
Agar, powder JUNSEI 24440S1201
Micropore Surgical tape 3M 1530-0
Surgical blade stainless No.10 FEATHER Unavailable
Conical Tube, 50ml SPL LIFE SCIENCES 50050
Macerozyme R-10 YAKULT PHARMACEUTICAL IND. Unavailable
Cellulase ONOZUKA R-10 YAKULT PHARMACEUTICAL IND. Unavailable
ALBUMIN, BOVINE (BSA) VWR 0332-100G
D-Mannitol SIGMA M1902-1KG
CALCIUM CHLORIDE, DIHYDRATE MP BIOMEDICALS 0219463505-5KG
Twister VISION SCIENTIFIC VS-96TW
Screen cup for CD-1 SIGMA S1145
Screens for CD-1 SIGMA S3895
Petri Dish SPL LIFE SCIENCES 10090
Pasteur pipette HILGENBERG 3150102
LABORATORY CENTRIFUGE / BENCH-TOP VISION SCIENTIFIC VS-5500N
Sodium chloride JUNSEI 19015S0350
Potassium chloride SIGMA P3911-1KG
D-GLUCOSE, ANHYDROUS BIO BASIC GB0219
Potassium Hydroxide DUKSAN 40
Calcium nitrate tetrahydrate SIGMA C2786-500G
Poly(ethylene glycol) SIGMA P2139-2KG
Magnesium chloride hexahydrate SIGMA M2393-500G
Tube 13ml, 100x16mm, PP SARSTEDT 55.515
Microscope slides MARIENFELD 1000412
Microscope Cover Glasses MARIENFELD 101030
Counting Chamber MARIENFELD 650030
Axioplan 2 Imaging Microscope Carl Zeiss Unavailable
Micro tube 1.5ml SARSTEDT 72.690.001
2-Mercaptoethanol SIGMA M3148-250ML
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), Proteomics Grade VWR M107-500G
TRIS, Ultra Pure Grade VWR 0497-5KG
DTT (DL-Dithiothreitol), Biotechnology Grade VWR 0281-25G
Bromophenol blue sodium salt ACS VWR 0312-50G
Glycerol JUNSEI 27210S0350
Living Colors A.v. Monoclonal Antibody (JL-8) TAKARA 632381

Referencias

  1. Jarvis, P., Lopez-Juez, E. Biogenesis and homeostasis of chloroplasts and other plastids. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 787-802 (2013).
  2. Neuhaus, H. E., Emes, M. J. Nonphotosynthetic Metabolism in Plastids. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 51, 111-140 (2000).
  3. Rolland, N., et al. The biosynthetic capacities of the plastids and integration between cytoplasmic and chloroplast processes. Annual Review of Genetics. 46, 233-264 (2012).
  4. Jarvis, P. Targeting of nucleus-encoded proteins to chloroplasts in plants. New Phytologist. 179 (2), 257-285 (2008).
  5. Li, H. M., Chiu, C. C. Protein Transport into Chloroplasts. Annual Review of Plant Biology. 61, 157-180 (2010).
  6. Keegstra, K., Cline, K. Protein import and routing systems of chloroplasts. Plant Cell. 11 (4), 557-570 (1999).
  7. Gasser, S. M., Daum, G., Schatz, G. Import of proteins into mitochondria. Energy-dependent uptake of precursors by isolated mitochondria. Journal of Biological Chemistry. 257 (21), 13034-13041 (1982).
  8. Smeekens, S., Bauerle, C., Hageman, J., Keegstra, K., Weisbeek, P. The role of the transit peptide in the routing of precursors toward different chloroplast compartments. Cell. 46 (3), 365-375 (1986).
  9. Lee, D. W., et al. Arabidopsis nuclear-encoded plastid transit peptides contain multiple sequence subgroups with distinctive chloroplast-targeting sequence motifs. Plant Cell. 20 (6), 1603-1622 (2008).
  10. Lee, S., et al. Mitochondrial targeting of the Arabidopsis F1-ATPase gamma-subunit via multiple compensatory and synergistic presequence motifs. Plant Cell. 24 (12), 5037-5057 (2012).
  11. Jin, J. B., et al. A new dynamin-like protein, ADL6, is involved in trafficking from the trans-Golgi network to the central vacuole in Arabidopsis. Plant Cell. 13 (7), 1511-1526 (2001).
  12. Lee, K. H., Kim, D. H., Lee, S. W., Kim, Z. H., Hwang, I. In vivo import experiments in protoplasts reveal the importance of the overall context but not specific amino acid residues of the transit peptide during import into chloroplasts. Molecules and Cells. 14 (3), 388-397 (2002).
  13. Lee, D. W., Lee, S., Oh, Y. J., Hwang, I. Multiple sequence motifs in the rubisco small subunit transit peptide independently contribute to Toc159-dependent import of proteins into chloroplasts. Plant Physiology. 151 (1), 129-141 (2009).
  14. Lee, D. W., Woo, S., Geem, K. R., Hwang, I. Sequence motifs in transit peptides act as independent functional units and can be transferred to new sequence contexts. Plant Physiology. 169 (1), 471-484 (2015).
  15. Lee, J., et al. Both the hydrophobicity and a positively charged region flanking the C-terminal region of the transmembrane domain of signal-anchored proteins play critical roles in determining their targeting specificity to the endoplasmic reticulum or endosymbiotic organelles in Arabidopsis cells. Plant Cell. 23 (4), 1588-1607 (2011).
  16. Cleary, S. P., et al. Isolated plant mitochondria import chloroplast precursor proteins in vitro with the same efficiency as chloroplasts. Journal of Biological Chemistry. 277 (7), 5562-5569 (2002).

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Citar este artículo
Lee, J., Kang, H., Hwang, I. Studying Protein Import into Chloroplasts Using Protoplasts. J. Vis. Exp. (142), e58441, doi:10.3791/58441 (2018).

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