Aquí presentamos un protocolo para separar complejos de tilacoides solubilizado por electroforesis nativa en verde. Bandas de gel verde posteriormente se caracterizan por tiempo correlacionó solo fotón contando (TCSPC) y pasos básicos para el análisis de los datos se proporcionan.
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Artículo de método
Separación de espinacas tilacoides complejos de proteínas por electroforesis en Gel verde nativo y caracterización de banda utilizando conteo de fotones solo Time-Correlated
En este artículo
Resumen
Resumen
Las reacciones de luz de la fotosíntesis se llevan a cabo por una serie de complejos de proteína pigmentada en las membranas tilacoides. La estequiometría y la organización de estos complejos es altamente dinámica en el largo y corto plazos debido a los procesos que se adaptan la fotosíntesis a las cambiantes condiciones ambientales (es decir, el amortiguamiento no fotoquímica, las transiciones de estado y la respuesta a largo plazo). Históricamente, estos procesos se han descrito espectroscópico en términos de cambios en la fluorescencia de la clorofila y espectroscopia sigue siendo un método esencial para el monitoreo de parámetros de fotosíntesis. Hay un número limitado de formas en que se puede visualizar la compleja dinámica de la proteína subyacente. Aquí describimos un método rápido y simple para la separación de alta resolución y visualización de complejos de tilacoides, electroforesis en gel verde nativo. Este método se combina con tiempo-correlacionada fotón contando para la caracterización detallada de las propiedades de fluorescencia de clorofila de bandas separadas en el gel verde.
Introducción
Organismos fotosintéticos constantemente deben ajustar su fisiología a las cambiantes condiciones ambientales para maximizar su productividad y competir con éxito con vecinos1. Esto es especialmente cierto de la maquinaria responsable de las reacciones de luz de la fotosíntesis, como luz ambiental condiciones pueden fluctuar por tres órdenes de magnitud entre las sombras y a plena luz del sol. Además, factores ambientales tales como sequía, frío o estrés por calor pueden reducir la disponibilidad de dióxido de carbono para la fijación de carbono, que es el fregadero del electrón natural para los productos de las reacciones de luz. Plantas deben....
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Protocolo
1. soluciones preparación para verter el gel verde nativo
- Preparar 4 x solución amortiguadora concentrada para resolver geles consisten en glicerol al 40%, glicina de 200 mM y 100 mM Tris amortiguada a pH 8.3.
- Preparar 4 x solución amortiguadora concentrada para apilar los geles consisten en glicerol al 40%, glicina de 200 mM y 100 mM Tris amortiguada a pH 6,3.
- Almacenar estos búferes a 4 ° C para evitar el crecimiento de moho.
Nota: Los topes son estables durante meses a 4 ° C, por lo que se recomienda la preparación de 100-200 mL de cada amortiguador para uso continuado. - Preparar 1 L de 10 x funcionamiento tampón que contie....
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Resultados
Resultados representativos para la electroforesis del gel verde se presentan en la figura 1. Carril 1 proporciona un ejemplo de resultados ideales para electroforesis en gel verde de espinaca tilacoides, en el que un número máximo de bandas verdes claro, agudos es accesibles. Estos resultados son un tanto atípicos, en parte porque no todas las bandas en el carril 1 normalmente están presentes en una muestra determinada. Limpieza adicional de la muestra, en fo.......
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Discusión
Un éxito tilacoides solubilización y gel nativo ejecutar resultará en la resolución de múltiples bandas verdes visibles distintas sobre el gel sin la distorsión significativa o mancharse de las bandas. Sobrecargar el gel, una alta concentración de detergente, un pH de muestra incorrecta, disuelta material, correr el gel a temperatura demasiado elevada o demasiado rápidamente y un gel incorrectamente vertido son factores que pueden contribuir a complejos de tilacoides mal resuelto. Y optimizar las condiciones del gel sí m.......
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Divulgaciones
Los autores no declaran conflictos de interés.
Agradecimientos
Financiación y apoyo fueron proporcionados por el Departamento de química de la Universidad Estatal de Michigan.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Glycine | Sigma | G8898 | |
| Tris base | Sigma | #648310 | |
| SDS | Sigma | L3771 | |
| Decyl Maltoside | Sigma | D7658 | n-decyl beta d maltopyranoside, no dodecyl maltósido o alfa decil maltósido |
| Octyl Glucoside | Sigma | O8001 | |
| Acrylamida | BioRad | 161-0148 | 37.5/1 C Solución al 40% |
| TEMED | BioRad | 161-0800 | |
| Persulfato de amonio | BioRad | 161-0700 | |
| Cloruro de magnesio | Sigma | M2670 | |
| Cloruro de potasio | Sigma | P9333 |
Referencias
- Yamori, W. Photosynthetic response to fluctuating environments and photoprotective strategies under abiotic stress. Journal of Plant Research. 129 (3), 379-395 (2016).
- Kim, J. H., Nemson, J. A., Melis, A.
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Reimpresiones y permisos
