在这里, 我们描述了一种基于细胞的检测方法, 以定量评估小胶质细胞对 tau 的吸收, 目的是创建一个研究工具, 以更好地描述抗 tau 抗体的作用机制。
阿尔茨海默病 (ad) 是一种进行性神经退行性疾病, 在这种情况下, 聚集的 tau 和淀粉样蛋白在大脑中积累, 导致神经元功能障碍, 最终导致认知能力下降。神经元中的高磷酸化 tau 集合体被认为是导致大多数与 ad 相关的病理原因。这些聚集物被假定被释放到细胞外的隔间, 并采取相邻的健康神经元, 在那里他们诱导进一步的 tau 聚集。这种 “prion 样” 的传播可以被能够结合和 “中和” 细胞外 tau 集合体的抗体打断, 如 ad 的临床前小鼠模型所示。治疗抗体减少病理的机制之一是抗体介导的接受和清除病理聚集形式的 tau 的微胶质细胞。在这里, 我们描述了一种基于细胞的定量检测方法, 以评估小胶质细胞对 tau 的吸收。该方法采用小鼠微胶质细胞系 bv-2, 具有高特异性、低变异性和中等吞吐量的特点。使用此检测生成的数据可有助于更好地表征抗陶抗体效应功能。
阿尔茨海默病 (ad) 是一种进行性神经退行性疾病, 其特征是淀粉样β肽和 tau 蛋白的构象改变和自组装成病理聚集体。正常可溶性淀粉样β肽转化为低聚和纤维淀粉样β, 而异常磷酸化 tau 积累为低聚物和神经纤维缠结 1,2。这些蛋白质聚集物导致神经元死亡, 导致记忆力丧失和随后的逐渐认知能力下降。其他因素, 包括非生产性神经炎症和清除错误蛋白质的能力下降, 可能会加剧和加速疾病。目前, 针对 ad 的干预策略在很大程度上提供了症状缓解, 但没有疾病改变治疗或预防。
越来越多的证据表明, 高磷酸化 tau 聚集体在 ad 的病理中起着关键作用。在非病理状态下, tau 是一种原生展开的蛋白质, 它与微管结合, 并促进它们组装成神经元细胞骨架。当 tau 变得高磷酸化时, 它从细胞骨架分离, 并在神经元中聚集成 tau 聚集体, 这被认为会导致与 ad3相关的大多数病理。聚集的 tau 开始首先在体内积累, 但随着疾病的进展, 它被认为是从受影响的神经元释放到细胞外空间, 它可以被相邻或突触连接的健康神经元在 “像 prion-like 的方式 “。一旦内化, tau 聚合通过模板化构象变化 4诱导进一步的 tau 聚合。
根据这一假设, 能够阻断 tau 种子的疗法可能会减缓或逆转陶氏介导的神经退行性疾病的进程。为了支持这一点, 因基因突变而容易受到肺病影响并被动注射抗 tau 抗体的小鼠表现出降低的 tau 病理和认知功能的改善 5, 6,7,8 ,9。然而, 治疗抗体减少病理的机制仍然难以捉摸。
其中一个建议的机制是抗体介导的吸收和清除病理聚集形式的 tau 的微胶质细胞, 大脑的常驻免疫细胞。最近的出版物表明, 微胶质细胞可以有效地内化和降解病理 tau 物种,这种能力通过 fc 依赖机制, 涉及 fc 受体在表面表达的增强, 抗 tau 抗体微胶质细胞和受体介导的吞噬作用 10,11。这些数据确定微胶质细胞是治疗抗体的潜在重要作用。
本文介绍了一种基于细胞的检测方法, 用于定量评估微胶质细胞对 tau 的吸收。这种检测产生的数据有助于阐明抗陶氏抗体的作用机制, 从而成为推进抗陶抗体作为潜在 ad 治疗的进一步发展步骤的有用工具。
小胶质细胞, 常驻大脑的免疫细胞, 最近被确定为重要的参与者抗体介导的治疗方法的 tau象 10,11。微胶质细胞抗体介导的 tau 清除, 以及神经元吸收9的阻断、纤维形成13、14的抑制或不稳定以及通过溶酶体对反病毒纤维的清除路径15, 可能有助于在小鼠模型中观察到的抗陶氏抗体的有效性5,6,7, 8,9.
我们在这里描述了一种基于细胞的检测方法, 用于定量评估微胶质细胞对 tau 的吸收, 目的是创建一个研究工具, 以更好地描述抗 tau 抗体的作用机制。
本试验, 改编自 funk等人.11、采用 bv-2 细胞, 为永垂小鼠微胶质细胞。虽然它们不能与初级微胶质细胞完全相比, 但它们具有初级微胶质细胞的许多特征, 包括体内的吞噬细胞以及β和 tau 纤维11、16、17 的能力,18,19。此外, 他们在体外表现出可重复的行为, 这使得他们非常适合于分析开发和定量研究, 这需要最小的实验变异性。除此之外, 与使用初级微胶质细胞相比, 不朽的细胞系可以获得更高的检测吞吐量, 并消除对动物牺牲的需求。
我们在本试验中使用的 tau 集料是利用我们最近描述的高度可重复的体外聚集过程获得的, 并显示出与从 ad 大脑中分离出的配对螺旋丝 (phf) 相似的形态患者。虽然我们没有观察到任何意想不到的结果, 可能已导致的 tau 聚集体粘附到塑料或玻璃表面, 使用稳定和良好的特征 tau 聚集体发挥了关键的作用, 在这种检测的重现性。
对检测重现性有显著贡献的另一个方面是细胞密度。协议中描述的每口井的细胞数量代表了所描述条件下的最佳细胞密度。
比芬克等人还多.11描述, 我们用 ph 敏感染料标记 tau 集料, 该染料在酸性细胞器中的内化时显著增加其荧光, 从而允许细胞内定量。这一点, 再加上表面结合免疫复合物和或 tau 的胰蛋白酶消化, 保证了流式细胞仪测量的荧光信号是 tau 吸收而不是与细胞表面结合的结果。此外, 使用 ph 敏感染料可以在显微镜实验中检测到内化的陶族, 而无需消化表面结合免疫复合物, 而需要重新电镀和回收细胞。
与前面描述的11相比, 我们还进一步优化了我们的检测的显微镜读出, 在我们的显微镜实验中使用了一种高度选择性的染料用于酸性细胞器, 这不仅使我们能够确认抗体介导在内溶酶体隔间中, 也有 tau 集料的定位。
我们开发的检测方法具有最佳的特异性, 从而形成了一个良好的实验窗口, 使阳性样本和阴性样品之间有了很强的分离。有趣的是, 该检测间接检测抗体亲和力的差异, 从而代表了研究抗陶抗体效应功能的有力工具。
The authors have nothing to disclose.
我们要感谢阿尔贝托·卡平泰罗·苏亚雷斯提供的宝贵技术援助。
BV-2 cells | ICLC Interlab Cell Line Collection | ATL03001 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) (1X) | Gibco | 10010-015 | |
Trypsin-EDTA 0.05% | Gibco | 25300-054 | |
DMEM 4.5 g/dl glucose | Gibco | 41966-029 | |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 10091-148 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
L-Glutamine 200mM | Lonza | 17-605E | |
EasYFlask | Nunc | 156499 / 159910 | |
pHrodo Green STP ester | Life Technologies | P35369 | |
Sodium Bicarbonate pH 8.5 100 mM | |||
DMSO | Sigma | D2650-100ml | |
PD10 columns | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
Greiner CELLSTAR multiwell culture plates | Greiner | 665180 | |
Falcon 96-Well Assay Plates | Falcon | 353910 | |
Heparin | Sigma | H3393-50KU | |
Trypsin-EDTA 0.25% | Sigma | T4049-100ml | |
BSA | Sigma | A7030-100G | |
EDTA 0.5M, pH8 | |||
FACS Canto II | BD | ||
Hoechst 33342 Solution (20 mM) | Thermo Fisher Scientific | 62249 | |
LysoTracker Deep Red | Thermo Fisher Scientific | L12492 | |
Opera Phenix | Perkin Helmer | HH14000000 |