Este protocolo proporciona un método confiable para establecer ratones humanizados con el sistema inmunitario humano y las células hepáticas. Los ratones inmunodeficientes duales reconstituidos logrados mediante inyección intraesplénica de hepatocitos humanos y células madre CD34+ hematopoyéticas son susceptibles a la infección por el virus de inmunodeficiencia humana-1 y al daño hepático recapitulado observado en Pacientes infectados por el VIH.
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Artículo de método
Establecimiento del modelo de ratón TK-NOG humanizado dual para la patogénesis hepática asociada al VIH
En este artículo
Resumen
Resumen
A pesar del aumento de la esperanza de vida de los pacientes infectados con el virus de la inmunodeficiencia humana-1 (VIH-1), la enfermedad hepática ha surgido como una causa común de su morbilidad. La inmunopatología hepática causada por el VIH-1 sigue siendo esquiva. Los modelos animales de xenoinjerto pequeños con hepatocitos humanos y el sistema inmunitario humano pueden recapitular la biología humana de la patogénesis de la enfermedad. En este documento, se describe un protocolo para establecer un modelo de ratón humanizado dual a través de hepatocitos humanos y CD34+ trasplante de células madre/progenitoras hematopoyéticas (HSPC), para estudiar la inmunopatología hepática observada en pacientes infectados por el VIH. Para lograr la reconstitución dual, el TK-NOG masculino (NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug Tg(Alb-TK)7-2/ShiJic) ratones se inyectan intraperitonealmente con dosis de ganciclovir (GCV) para eliminar las células hepáticas transgénicas del ratón, y con treosulfán para el acondicionamiento no mieloablativo, los cuales facilitar el injerto de hepatocitos humanos (HEP) y el desarrollo del sistema inmunológico humano (HIS). Los niveles de albúmina humana (ALB) se evalúan para el injerto hepático, y la presencia de células inmunitarias humanas en la sangre detectadas por citometría de flujo confirma el establecimiento del sistema inmunitario humano. El modelo desarrollado utilizando el protocolo descrito aquí se asemeja a múltiples componentes de daño hepático por infección por VIH-1. Su establecimiento podría resultar esencial para los estudios de la coinfección por el virus de la hepatitis y para la evaluación de medicamentos antivirales y antirretrovirales.
Introducción
Desde el advenimiento de la terapia antirretroviral, se ha producido una disminución sustancial de las muertes relacionadas con la monoinfección del VIH-1. Sin embargo, la enfermedad hepática ha surgido como una causa común de morbilidad en pacientes infectados por el VIH1,2. Las coinfecciones de virus de la hepatitis con infección por VIH-1 son más frecuentes, y representan entre el 10% y el 30% de las personas infectadas por el VIH en los Estados Unidos3,4,5.
La especificidad del huésped ....
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Protocolo
Este protocolo ha sido aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) en el Centro Médico de la Universidad de Nebraska.
NOTA: Obtener la aprobación de la IACUC local antes de realizar experimentos con animales.
1. Procesamiento de la sangre del cordón umbilical y el aislamiento de los HSpC shumanos
- Realice todos los pasos del protocolo en condiciones estériles en armarios de flujo laminar.
- Tomar la sangre del cordón umbilical (CB) recogida en tubos heparinizados y hacer el volumen hasta 35 ml mediante la adición de solución salina tamponada de fosfa....
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Resultados
El establecimiento de un modelo de ratón humanizado dual con hígado humano y células inmunitarias se puede monitorear fácilmente en cada paso con ELISA y citometría de flujo muy simple, respectivamente. La citometría de flujo se realiza regularmente para evaluar el desarrollo de un sistema inmunitario funcional y para ver el efecto de la infección por VIH en las células inmunitarias. En ratones humanizados duales, el desarrollo de células inmunitarias funcionales puede variar del 15% al 9.......
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Discusión
El hígado está comprometido y dañado en pacientes infectados por el VIH24. Los modelos experimentales de animales pequeños para el estudio de las enfermedades hepáticas humanas en presencia del VIH-1 son extremadamente limitados, a pesar de la disponibilidad de algunos modelos animales cotrasplantes con CD34+ HSPC y hepatocitos7,12, 25. En experimentos in vitro, se ha demostrado que los hepato.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por la beca R24OD018546 del Instituto Nacional de Salud (a L.Y.P. y S.G.). Los autores quieren agradecer a Weizhe Li, Ph.D., por la ayuda en procedimientos quirúrgicos, Amanda Branch Woods, B.S., Yan Cheng para inmunohistología, miembros del centro de investigación de citometría de flujo de la UNMC Phillip Hexley, Ph.D., Victoria B. Smith, B.S., y Samantha Wall, B.S., miembros avanzados de las instalaciones centrales de microscopía Janice A. Taylor, B.S., y James R. Talaska, B.S., para el apoyo técnico. Los autores reconocen a los Doctores Mamoru Ito y Hiroshi Suemizu de CIEA por proporcionar ratones TK-NOG y al Dr. Joachim Baumgart por propor....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Agujas de 27 G1/2" | BD biosciences | 305109 | |
| 30 agujas de G1/2" | BD biosciences | 305106 | |
| 5 mL de poliestireno tubo de fondo redondo de 12 mm x 75 mm estilo | Corning | 352054 | |
| BD 1 mL Jeringa de tuberculina sin aguja | BD biosciences | 309659 | |
| BD FACS array bioanalyzer | BD Biosciences | Para el control de pureza de células CD34+ eluidas | |
| Software de matrices BD FACS | BD Biosciences | Software para el análisis adquirido de células CD34+ en matrices FACS | |
| Solución de lisado BD FACS | BD Biosciences | 349202 | Para lisar glóbulos rojos |
| BD LSR II | BD Biosciences | Instrumento para la adquisición de muestras de citometría de flujo | |
| BD Vacutainer Tubo de Extracción de Sangre de Plástico | BD biosciences | BD 367874 | Para recolectar Sangre de cordón umbilical |
| Bovino Albúmina sérica | Sigma-aldrich | A9576 | |
| Buprenorfina | Sustancia controlada y analgésico | ||
| CD14-PE | BD Biosciences 555398 | Específico para humanos | |
| CD19-BV605 | BD Biosciences | 562653 | Específico para humanos |
| CD34 MicroBead Kit, humanos | Miltenyi Biotec | 130-046-702 | Para el aislamiento de CD34+ HSPC |
| CD34-PE, humano | Miltenyi Biotec | 130-081-002 | Anticuerpo utilizado para la comprobación de la pureza de células CD34+ eluidas |
| CD3-AF700 | BD Biosciences | 557943 | Específico para humanos |
| CD45-PerCPCy5.5 | BD Biosciences | 564105 | Específico para humanos |
| CD4-APC | BD Biosciences 555349 | Específico para humanos | |
| CD8-BV421 | BD Biosciences | 562428 | Específico para humanos |
| Portaobjetos de recuento de células | Bio-rad | 1450015 | |
| ChargeSwitch gDNA Mini Tissue Kit | Thermofisher CS11204 científico | para la extracción de ADN genómico del | |
| auricular Cobas Amplicor system v1.5 | de Roche Molecular Diagnostics | para medir la carga viral | |
| Aplicadores con punta de algodón | McKesson | 24-106-2S | |
| Citoqueratina-18 (CK18) | DAKO | M7010 | Específico para |
| DMSO humano (Dimetilsulfóxido) | Sigma-aldrich | D2650-5X5ML | |
| Juego de extensión Microbore Abrazadera de corredera (s) Fijo Macho Luer Lock. L: 60 pulgadas L: 152 cm PV: 0,55 mL Ruta del fluido Estéril | BD biosciences | 30914 | Acoplado al pipete dispensador y para cargar con HSPC y HEP suspesion |
| FACS Diva versión 6 | Biosciences | software de citómetro de flujo requerido para adquisición de muestra | |
| Suero fetal bovino (FBS) | Gibco | 10438026 | |
| FLOWJO software de análisis v10.2 | FLOWJO, | LLC software de análisis de citometría de flujo | |
| Ganciclovir | APP Pharmaceuticals, Inc. | 315110 | Medicamento de prescripción |
| Greiner MiniCollect Tubos de EDTA | Greiner bio-one | 450475 | |
| Medio de descongelación de hepatocitos | Laboratorios de investigación Triangle | MCHT50 | |
| Horizon Open Ligating Clip Appliers | Teleflex | 537061 | Para sujetar los clips de ligadura |
| Hospira Sterile Water for Injection | ACE surgical supply co. Inc. | 001-1187 | Para la dilución de buprenorfina (analgésico) |
| Albúmina humana ELISA Set de cuantificación | Bethyl | laboratories E80-129 | Para la evaluación de los niveles de albúmina humana en suero de ratón |
| Hepatocito humano | Triangle Research Labs | HUCP1 | Hepatocitos humanos criopreservados, calificados para inducción |
| Tijeras de iris, recto | Ted Pella, Inc. | 13295 | |
| Lancet | MEDIpoint | Goldenrod 5 mm | |
| LS columnas | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Se utiliza para atrapar microperlas CD34+ (selección positiva) |
| Medio de separación de linfocitos (LSM) | MP Biomedicals | 50494 | Para la aislamiento de linfocitos de sangre periférica |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | contiene el separador Qudro MACS y las columnas LS |
| McPherson-Vannas Micro Tijeras de resorte de disección | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5605 | Se utiliza para hacer una incisión en la piel para exponer el bazo |
| Micro Pinzas de disección | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5157 | para sostener y extraer el bazo de la cavidad peritoneal |
| ratón CD45-FITC | BD Biosciences | 553080 | para ratón |
| PBS (solución salina tamponada con fosfato) | Hyclone | SH30256.02 | |
| Qudro MACS separador | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | tiene cuatro columnas LS: |
| RPMI 1640 mediano | Gibco | 11875093 | |
| StepOne Plus Real Time PCR | Biosystems | Aplicado Instrumento utilizado a genotipo | |
| Serie Stepper Pipeta dispensadora repetitiva 1ml | DYMAX CORP | T15469 | Utilizado para dispensar Suspensión de HSPC y HEP de forma controlada |
| Suturevet PGA sutura absorbale sintética | Henry Schein Animal Health | 41178 | Sutura de piel y peritoneo |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Contador de células automatizado Thermofisher scientific | ||
| TC20 | Bio-rad | 1450102 | |
| ratones TK-NOG | Proporcionado por el Instituto Central de Animales de Experimentación (CIEA, Japón; Dres. Mamoru Ito e Hiroshi Suemizu) | ||
| Treosulfan | Medac GmbH | Proporcionado por Dr. Joachim Baumgart (medac GmbH) | |
| Vannas Bio-rad Bio-1450022 | Trypan | ||
| , rectas, 80mm L | Ted Pella, Inc. | 1346 | Se utiliza para hacer una incisión en la piel para exponer el bazo |
| Weck hemoclip clips de ligadura de titanio tradicionales | Esuturas | 523700 | Para ligar el bazo después de la inyección |
Referencias
- Smith, C., et al. Factors associated with specific causes of death amongst HIV-positive individuals in the D:A:D Study. AIDS. 24 (10), 1537-1548 (2010).
- Puoti, M., et al. Mortality for liver d....
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