Aquí, presentamos un protocolo altamente accesible para evaluar el movimiento de la célula en células de trofoblasto humano mediante tres ensayos in vitro: el ensayo de rayado, el ensayo de invasión transwell y el ensayo de proliferación celular.
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Artículo de método
En los ensayos de Vitro para evaluar la migración, invasión y proliferación de las líneas de células inmortalizadas trofoblasto humano de primer trimestre
En este artículo
Resumen
Resumen
Movimiento celular es una propiedad crítica de trofoblastos durante el desarrollo placentario y embarazo precoz. Se demuestra la importancia de la migración del trofoblasto adecuada e invasión por trastornos de embarazo tales como restricción del crecimiento intrauterino y de la preeclampsia, que se asocian con invasión inadecuada del trofoblasto de la vasculatura materna. Por desgracia, nuestra comprensión de los mecanismos por el que se desarrolla la placenta migre trofoblastos es limitada. Análisis in vitro de la migración celular mediante el ensayo de scratch es una herramienta útil en la identificación de factores que regulan la capacidad migratoria de trofoblasto. Sin embargo, este ensayo sólo definir los cambios celulares que pueden resultar en migración de la célula alterada. Este protocolo describe tres diferentes ensayos in vitro que se utilizan conjuntamente para evaluar movimiento de trofoblasto celular: el ensayo de rayado, el ensayo de invasión y el ensayo de proliferación. Los protocolos descritos aquí pueden modificarse para su uso en otras líneas celulares para cuantificar el movimiento de la célula en respuesta a estímulos. Estos métodos permiten a los investigadores a identificar los factores individuales que contribuyen al movimiento de la célula y un minucioso examen de los mecanismos potenciales subyacentes cambios aparentes en la migración celular.
Introducción
Desarrollo placentario es un paso crucial en el establecimiento del embarazo, que afectan la salud materna y fetal. Sin embargo, la base mecanicista por el cual este proceso se produce no se entiende completamente. Migración celular es un proceso biológico importante que contribuye a la creación y funciones de la placenta durante el embarazo. Tras la implantación del blastocisto, el trophectoderm distingue en trofoblastos vellosos, que cubren la superficie de las vellosidades coriónicas y participan en el intercambio de nutrientes y gas, y trofoblastos extravillous (EVTs), que migran hacia fuera de las vellosidades e invaden la decidua y la vasculatura materna
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Protocolo
1. preparación de la célula
- Mantener las células en frascos de T-75 en medios de crecimiento estándar a 37 ° C, 5% CO2y 95% de humedad.
Nota: Las células utilizadas en estos experimentos fueron el inmortalizado células de trofoblasto en el primer trimestre las líneas Swan.71 (Sw.71) y HTR-8/SVneo9,10. Las células Sw.71 se mantuvieron en DMEM/F-12 suplementado con 10% inactivado con calor suero bovino fetal (FBS), piruvato de sodio 1,0 mM, 10 mM HEPES, 0.10 m m MEM no esenciales aminoácidos, 100 unidades/mL de penicilina y estreptomicina μg/mL 100. Las células de HTR-8/S....
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Resultados
Las líneas de células inmortalizadas trofoblasto humano de primer trimestre Sw.71 y HTR-8/SVneo fueron utilizadas en estos experimentos para determinar el papel de los glucocorticoides en el trofoblasto celular migración12. Glucocorticoides fueron utilizados en estos experimentos, como recientemente han demostrado para alterar las funciones del trofoblasto, aunque los tratamientos alternativos pueden ser utilizado12. Ambas líneas celulares f.......
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Discusión
Este procedimiento basa en el uso de migración y la invasión ensayos para incluir la tasa de proliferación celular como un colaborador potencial medidos diferencias en el movimiento de células de trofoblasto. Juntos, estos ensayos in vitro son métodos sencillos y eficaces que pueden utilizarse para identificar las vías celulares que regulan la migración del trofoblasto. Como se describió anteriormente, las células del trofoblasto pueden tratarse con hormonas, citoquinas, factores de crecimiento y otras moléculas para det.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores agradecen a Dr. Gil Mor para proporcionar las células Sw.71. Esta investigación fue apoyada por un Premio Albert McKern erudito para S.W.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 0,4% Tinción azul de tripano | Thermo Fisher Scientific | 15250-061 | |
| 0,5% Tripsina-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| 1,0 M HEPES | AmericanBio | AB06021-00100 | |
| 10 mM MEM aminoácidos no esenciales | Life Technologies | 11140-050 | |
| 100 mM piruvato de sodio | Life Technologies | 11360-070 | |
| Placa de 24 pocillos insertos transwell | Corning | 3422 | Contienen filtros de policarbonato con un 8 μ m tamaño de poro |
| Carbón vegetal sin dextra FBS | Gemini Bio-Products | 100-119 | |
| Countess II Contador de células automatizado | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| Crystal Violet | Sigma Aldrich | C0775 | |
| Cytoseal 60 | Thermo Fisher Scientific | 8310-4 | |
| Dexametasona (Dex; 1, 4-pregnadien-9&alfa;-fluoro-16&alfa;-metil-11β, 17, 21-triol-3, 20-diona; ≥ 98% TLC) | Esteraloides | P0500-000 | |
| DMEM/Jamón' s F12 | Life Technologies | 11330-032 | |
| Suero fetal bovino | Sigma Aldrich | F2442 | |
| IncuCyte Placas ImageLock de 24 pocillos | Essen BioScience | 4365 | Si utiliza el sistema de imágenes IncuCyte Zoom, siembre las células en las placas IncuCyte ImageLock. Estas placas tienen marcadores de referencia en la parte inferior de la placa que se utilizan como referencia para la repetición de imágenes en un campo de visión constante. |
| Software IncuCyte | Essen BioScience | 2010A Rev2 | |
| Sistema IncuCyte ZOOM | Essen BioScience | N/A | Las imágenes del ensayo Scratch se capturaron y analizaron utilizando el preajuste " Herida por rasguño" en el sistema IncuCyte ZOOM. También se pueden utilizar otros microscopios de lapso de tiempo. |
| Matrigel Matriz de membrana | Becton Dickinson | 356231 | Factor de crecimiento reducido, libre de rojo fenol |
| Micro Portaobjetos | VWR International, LLC | 48311-7003 | |
| Cubreobjetos de microscopio | Fisher Scientific | 12-545-E | |
| Microscopio invertido Olympus IX71 | Penicilina Olympus | IX71 | |
| (10.000 unidades/mL)/estreptomicina (10.000 y micro; g/mL) | Life Technologies | 151-40-122 | |
| Libre de rojo fenol DMEM/Ham's F12 | Life Technologies | 11039-021 | |
| Herramienta semiautomática para hacer heridas | Essen BioScience | N/A |
Referencias
- Ji, L., et al. Placental trophoblast cell differentiation: Physiological regulation and pathological relevance to preeclampsia. Molecular Aspects of Medicine. 34 (5), 981-1023 (2013).
- Caniggia, I., Winter, J., Lye, S., Post, M.
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Reimpresiones y permisos
