Aquí, presentamos un protocolo para infectar fibroblastos dérmicos humanos primarios con MCPyV. El protocolo incluye aislamiento de fibroblastos dérmicos, preparación de viriones MCPyV, infección por el virus, tinción de inmunofluorescencia y fluorescencia hibridación in situ. Este protocolo puede ampliarse para caracterizar las interacciones MCPyV-host y descubrir otros tipos de células infectables por MCPyV.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Poliomavirus de células de Merkel la infección y la detección
* These authors contributed equally
En este artículo
Resumen
Resumen
Merkel cell polyomavirus (MCPyV) infección puede conducir al carcinoma de la célula de Merkel (MCC), una forma altamente agresiva de cáncer de piel. Estudio de mecanismos para investigar completamente MCPyV molecular biología y mecanismos oncogénicos ha visto obstaculizado por la falta de modelos de cultivo celular adecuado. Aquí, describimos un conjunto de protocolos para realizar y detectar MCPyV la infección de células de piel humana primaria. Los protocolos describen el aislamiento de los fibroblastos dérmicos humanos, preparación de viriones recombinantes de MCPyV y la detección de infección por el virus por tinción de inmunofluorescencia (IF) y in situ hibridación de ADN reacción en cadena (HCR), que es muy sensible fluorescencia en el enfoque de situ del hibridación (pescado). Los protocolos en este documento pueden ser adaptados por los investigadores interesados a identificar otros tipos de células o líneas celulares compatibles con infección MCPyV. El enfoque descrito de pescado también podría adaptarse para detectar bajos niveles de ADN viral presente en la piel humana infectada.
Introducción
Polyomavirus de la célula de Merkel (MCPyV) es un virus ADN pequeño, doble hebra que se ha asociado con un cáncer de piel raro pero agresivo, Merkel cell carcinoma (MCC)1,2. La tasa de mortalidad de MCC, alrededor del 33%, supera la de melanoma3,4. MCPyV tiene un genoma circular de ~ 5 kb1,5 atravesada por una región reguladora no codificante (NCRR) en regiones1codificación de temprano y tarde. El NCRR contiene el origen viral de replicación (Ori) y de bidireccional prom....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
Prepucio neonatal humana fueron obtenido del centro de investigación de la enfermedad de la piel de Penn. Fibroblastos humanos adultos fueron obtenidos de piel normal desechada después de la cirugía. Todos los protocolos fueron aprobados por la Universidad de Pennsylvania Junta de revisión institucional.
1. aislamiento de fibroblastos dérmicos humanos
- Utilice un par de tijeras recorte el tejido subcutáneo y grasa de prepucio neonatal humano y cortar la muestra de piel en mitades o cuartos.
- Incubar el tejido en 5 mL de dispase II en PBS suplementado con antibiótico-antimicótico de 10 mg/mL a 4 ° C durante la noche. ....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
El protocolo descrito en este manuscrito permitieron el aislamiento de una población casi homogénea de HDFs (figura 1). Según lo demostrado por la coloración inmunofluorescente, casi el 100% de los aislados de las células cutáneas humanas usando las condiciones descritas en este protocolo fueron positivamente mancharon para el colágeno, el vimentin y marcadores de fibroblastos dérmicos yo24, pero negativo para el ser humano marcador de.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
Los métodos descritos arriba, incluyendo el aislamiento de fibroblastos dérmicos de tejido de la piel humana, preparación de viriones recombinantes de MCPyV, infección de las células cultivadas, coloración inmunofluorescente y un método sensible de peces adaptado de tecnología HCR, que debe permitir a los investigadores a analizar MCPyV infección27. Uno de los pasos más críticos para lograr MCPyV infección in vitro es la producción de preparaciones de virus de alto título. Utilizando el protocolo .......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores desean agradecer al Dr. Meenhard Herlyn (Instituto de Wistar) y el Dr. M. Celeste Simón (Universidad de Pennsylvania) reactivos y apoyo técnico. También agradecemos a los miembros de nuestros laboratorios de discusión útil. Este trabajo fue apoyado por las donaciones de institutos nacionales de salud (NIH) (R01CA187718, R01CA148768 y R01CA142723), la beca de apoyo de centro NCI cáncer (NCI P30 CA016520) y el premio Penn CFAR (P30 AI 045008).
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Suero fetal para terneros | HyClone | SH30071.03 | |
| MEM Solución de aminoácidos no esenciales, 100X | Thermo Fisher Scientific | 11140050 | |
| GLUTAMAX I, 100X | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | L-Glutamina |
| DPBS, sin calcio, sin magnesio | Thermo Fisher Scientific | 14190136 | |
| 0.05% Tripsina-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25300-054 | |
| DMEM/F12 medio | Thermo Fisher Scientific | 11330-032 | |
| Proteína EGF humana recombinante, CF | R& Sistemas D | 236-EG-200 | Almacenar a -80 grados centígrados |
| CHIR99021 | Cayman Chemical | 13122 | Almacenar a -80 grados centígrados |
| CHIR99021 | Sigma | SML1046 | Almacenar a -80 grados centígrados |
| Colagenasa tipo IV | Thermo Fisher Scientific | ||
| Dispasa II | Roche | 4942078001 | |
| Antibiótico-Antimicótico | Thermo Fisher Scientific | 15240-062 | Proteger de la luz |
| DMEM | medio Thermo Fisher Scientific | 11965084 | |
| Alexa Fluor 594 cabra anti-ratón IgG | Thermo Fisher Scientific | A11032 | Proteger de la luz |
| Alexa Fluor 488 cabra anti-conejo IgG | Thermo Fisher Scientific | A11034 | Proteger de la luz |
| OptiPrep Density Gradient Medio | Sigma | D1556 | Proteger de la luz |
| Paraformaldehído | Sigma | P6148 | |
| anti-MCPyV LT (CM2B4) | Santa Cruz | sc-136172 | Lote # B2717 |
| MCV VP1 conejo | Suero policlonal de conejo #10965 | https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm | |
| Higromicina | Roche | 10843555001 | |
| Factores básicos de crecimiento de fibroblastos (bFGF), recombinantes humanos | Corning | 354060 | Almacenar a -80 grados centígrados |
| Benzonasa nucleasa | Sigma | E8263 | |
| DNasa dependiente de ATP segura para plásmidos | EPICENTRO | E3101K | |
| Tampón de hibridación de sondas | Tecnologías | ||
| Tampón de lavado de sondas | Tecnologías moleculares | ||
| Tampón de amplificación | Tecnologías | ||
| moleculares Horquillas marcadas con Alexa 594 | Tecnologías moleculares | B4 | Proteger de la luz |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Quant-iT PicoGreen Reactivo dsDNA | Thermo Fisher Scientific | P7581 | |
| BamHI-HF | NEB | R3136 | |
| Tampón PB | Qiagen | 19066 | |
| columna de centrifugación miniprep azul | Qiagen | 27104 | |
| Tubos de centrífuga cónicos de 50 ml | Corning | 352070 | |
| T4 ligasa | NEB | M0202T | |
| MagicMark XP | Thermo Fisher Scientific | LC5602 |
Referencias
- Gjoerup, O., Chang, Y. Advances in Cancer Research. Vande Woude, G., Klein, G. 106, Academic Press. 1-51 (2010).
- Feng, H., Shuda, M., Chang, Y., Moore, P. S. Clonal integration of a polyomavirus in human Merkel cell carcinoma. Science. 319, 1096-1100 (2008).
- Lemos, B., Nghiem, P.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
