Summary

Rab10 인산화를 평가하여 파킨슨병 관련 LRRK2 키나아제 경로를 심문하기 위한 인간 말초 혈액 호중구 격리

Published: March 21, 2020
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Summary

류신이 풍부한 반복 키나아제 2 유전자(LRRK2)의 돌연변이는 유전성 파킨슨병을 일으킨다. 우리는 인간 말초 혈액 호중구에서 Rab10의 LRRK2 대조 인산화를 평가하기위한 쉽고 강력한 방법을 개발했습니다. 이 증가 LRRK2 키 나 제 통로 활동을 가진 개인을 식별 하는 데 도움이 수 있습니다.

Abstract

류신이 풍부한 반복 키나아제 2(LRRK2)는 유전성 파킨슨병(PD)에서 가장 빈번하게 돌연변이되는 유전자이며 모든 병원성 LRRK2 돌연변이는 키나아제 기능의 과활성화를 초래한다. 여기서, 우리는 그것의 생리적 기질 중 하나인 Rab10을 트레오닌 73에서 LRRK2 대조 포스포릴화를 측정함으로써 인간 말초 혈액 호중구에서 LRRK2 키나아제 통로 활성을 정량화하는 쉽고 강력한 분석방법을 기술한다. 기재된 면역블로팅 분석은 MJFF-pRab10 토끼 모노클로날 항체와 같은 LRRK2에 의해 인산화된 Rab10 Thr73 에피토프를 인식하는 완전 선택적 및 인광특이적 항체를 필요로 한다. 말초 혈액은 쉽게 접근 할 수 있고 호중구는 풍부하고 균일 한 구성 요소이기 때문에 인간의 말초 혈액 호중구를 사용합니다. 중요한 것은, 호중구는 LRRK2와 Rab10 둘 다의 상대적으로 높은 수준을 표현합니다. 호중구의 잠재적인 단점은 그들의 높은 본질적인 세린 프로테아제 활성, 유기 인스포러스 신경 독소 디이소프로필플루오로프포스산염 (DIFP)와 같은 매우 강력한 프로테아제 억제제의 사용을 필요로 하는 리시저 완충제의 일부입니다. 그럼에도 불구하고, 호중구는 생체 내에서 LRRK2 키나아제 통로 활성에 대한 연구를 위한 귀중한 자원이며 PD 생체 저장소 컬렉션에 포함시키는 것으로 고려되어야 한다.

Introduction

파킨슨 병 (PD)을 늦추거나 멈추려는 시도는 지금까지 실패했습니다. 류신이 풍부한 반복 키나아제 2(LRRK2)에서 의한 과다 활성화 돌연변이의 발견은 PD에 대한 위험을 증가시키고 있거나 증가시키는 LRRK2 키나아제 억제제1,,2,,3의발달로 이어졌다. 이들은 지금 임상 시험4를입력했습니다. LRRK2의 정확한 기능은 불분명하지만, 주요 발전은 LRRK2 키나제,5,6,7의첫 번째 보나 피라제 생리기로서 Rab10을 포함하는 랍 GTPase 단백질의 서브세트의 식별이었다.7 질병 변형 치료제의 시대에 주요 과제는 LRRK2 키나아제 활성화 상태의 생화학적 마커및 LRRK2 키나제 억제제의 표적 결합이다.

지금까지, 생체 내 LRRK2 억제제의 주요 약동학 마커는 LRRK2의 구성적으로 인산화된 세린 잔기의 클러스터였으며, 특히 세린 935는 다양한 LRRK2억제제8,,9에반응하여 탈인성화된다. 그러나, 세린 935 인산화는 LRRK2에 의해 직접적으로 인산화되지 않고 여전히 키나제 비활성LRRK2(10)에서인산화되지 않기 때문에 본질적인 세포 LRRK2 키나아제 활성과 상관관계가 없다. LRRK2 키나아제 활성은 세린(1292)의 오토포스포릴레이션과 잘 상관되지만, 본부위에,대한 신뢰할 수 있고 인특이적인 항체의 현재 부족으로 인해 전체 세포 추출물의 면역블롯 분석에 의한 내인성 LRRK2 키나아제 활성에 대한 적절한 판독은 실질적으로아니다.

우리는 스레오닌 7311에서LRRK2 대조 단백질 Rab10의 생리적 표적 인산화를 측정하는 인간 말초 혈액 세포에서 LRRK2 키나아제 경로 활성을 정량화하는 강력하고 쉬운 분석방법을 개발했습니다. 말초 혈액은 최소한의 불편을 일으키는 원인이 되는 낮은 리스크 그리고 빠른 절차인 베니섹션에 의해 쉽게 접근할 수 있습니다. 우리는 인간 말초 혈액 호중구에 초점을 맞추기 때문에 그들은 풍부 (모든 백혈구의 37-80%)와 LRRK2와 Rab1011둘 다의 상대적으로 높은 수준을 발현하는 균질한 세포 인구. 더욱이, 말초 혈액 호중구는 면역자기 음성 접근법을 채택하여 신속하고 효율적으로 단리될 수 있다. 후속 관찰된 Rab10 인산화가 LRRK2에 의해 매개되도록 하기 위해, 호중구의 각 배치는 강력하고 선택적인 LRRK2 키나아제 억제제의 유무에 관계없이 배양된다(MLi-2를 사용하고 권장한다)2,,12. 이어서 프로테아제 억제제 디이소프로필 플루오로포스페이트(DIFP)를 함유하는 완충제에서 세포 용해가 이어서호중구(13)에서높은 것으로 알려진 본질적인 세린 프로테아제 활성을 억제하는 데 필요하다. 정량적 면역블로팅에 의한 최종 분석을 위해, Rab10 Thr73-phoepitope를 특이적으로 검출하고 다른 인산화 된 랍 단백질(14)과교차 반응하지 않는 MJFF-pRab10 토끼 단클론 항체를 사용하는 것이 좋습니다. 이 항체의 선택성 및 특이성은 상이한 랍 단백질 및 A549 Rab10 녹아웃세포주(14)의과발현 모델에서 검증되었다. 따라서, 강력하고 선택적인 LRRK2 키나아제 억제제2를이치에 없이 처리된 호중구 매립제에서 Rab10 인산화의 차이를 측정한다. 양자택일로, 견본은 또한 정량 질량 분석과 같은 그밖 방법에 의해 분석될 수 있었습니다.

결론적으로, LRRK2 대조군 Rab10 인산화는 세린 935및 인간 말초 혈액 호중구에서 LRRK2 인산화에 LRRK2 키나아제 활성의 우수한 마커이며, 인간 말초 혈액 호중구는 LRRK2에 대한 PD 연구에 귀중한 자원이다. 당사의 프로토콜은 말초 혈액 호중구에서 LRRK2 경로 활성을 심문하는 강력하고 쉬운 분석을 제공하고 증가된 LRRK2 키나아제 활성15를가진 개인의 생화학적 계층화를 허용한다. 중요하게는, 그러한 개인은 향후 LRRK2 키나아제 억제제 치료로부터 혜택을 받을 수 있다.

Protocol

현지 영국 규정에 따르면 인간의 혈액의 모든 조작과 파이펫팅은 카테고리 2 생물학적 안전 캐비닛에서 수행됩니다. 모든 절차는 지역 윤리 검토 위원회에 따라 수행되었으며 모든 참가자는 정보에 입각한 동의를 제공했습니다. 1. 준비 인산완식염수(PBS)에 100 mM EDTA를 함유한 EDTA 스톡 솔루션 1의 0.1 mL을 준비합니다. PBS에서 1 mM EDTA를 포함하는 EDTA 스톡 솔루션 2?…

Representative Results

우리의 분석법은 LRRK2 의존적 Rab10 인산화를 판독으로 인간 말초 혈액 호중구에서 PD 관련 LRRK2 키나아제의 활성화를 심문할 수 있게 한다. 호중구는 LRRK2 및 Rab10 단백질 둘 다의 상부를 발현하는 균질하고 풍부한 말초 백혈구 집단이다(그림1). 두 단백질의 높은 사본 수를 가진 나머지 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 중 유일한 그밖 세포 인구는 단핵구입니다, 그러나 이들은 백혈구?…

Discussion

강력한 임상, 유전 및 생화학적 증거는 LRRK2및 특히 파킨슨 병에서 의 키나아제 기능에 대한 중요한 역할을지적7. LRRK2 키나아제 억제제가 개발되어 임상 시험2,,4,,12에진입하고 있다. 이와 같이 LRRK2를 환자 계층화뿐만 아니라 표적 참여에 대한 바이오마커로 활용할 필요성이 있다. 당사의 프로토콜은 인간 말?…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

본 연구를 위해 혈액을 기증해 주신 건강한 자원봉사자들에게 감사드립니다. 마이클 J. 폭스 파킨슨 연구 재단(MJFF)과 폭스 바이오넷 연구 리더십(FBN)이 서면 프로토콜과 비디오에 대한 지원과 의견을 제시해 주신 것에 대해 감사드립니다. 오스트리아 비엔나 대학의 알렉산더 질프리치 교수님이 당사의 프로토콜과 협업을 테스트해 주신 것에 대해 감사드립니다. 우리는 프로젝트 (MRC PPU의 일반 관리자)에 폴 데이비스의 기여를 소중히. 우리는 또한 MRC 단백질 인산화 및 유비퀴틸화 유닛 (PPU) 즉 화학 합성 (MLi-2 합성을위한 나탈리아 슈피로), MRC PPU 시약 및 서비스 항체 정제 팀의 우수한 기술 지원을 인정합니다 (에 의해 조정됨) 힐러리 맥라우클란과 제임스 하스티). 우리는 비디오와 애니메이션을 만드는 데 도움을 비보 모션에서 Mhairi 토울러와 프레이저 머독에게 감사드립니다. 81편의 영화에서 스티브 소아브(Steve Soave)가 최종 편집에 도움을 주신 것에 대해 감사드립니다. 에스더 샘러는 스코틀랜드 수석 임상 학술 펠로우십의 지원을 받고 있으며 파킨슨 병의 영국 (K-1706)으로부터 자금을 지원받았습니다.

Materials

1 mL Pipette tips Sarstedt 70.762 or equivalent
1.5 mL Micro tubes Sarstedt 72.690.001 or equivalent
10 mL Pipette tips  Sarstedt 86.1254.025  or equivalent
10 μL Pipette tips Sarstedt 70.113 or equivalent
15 mL falcon tube  Cellstar 188 271 or equivalent
200 μL Pipette tips Sarstedt 70.760.002 or equivalent
25 mL Pipette tips  Sarstedt 86.1685.001 or equivalent
50 mL falcon tube  Cellstar 227 261 or equivalent
BD Vacutainer Hemogard Closure Plastic K2-EDTA Tube BD  BD 367525 or equivalent
Beckman Coulter Allegra X-15R centrifuge Beckman or equivalent centrifuge with swimging bucket rotator for 15 mL and 50 mL falcon tubes at speed 1000-1200 x g
Category 2 biological safety cabinet.
cOmplete(EDTA-free) protease inhibitor cocktail Roche 11836170001
DIFP (Diisopropylfluorophosphate)  Sigma D0879 Prepare 0.5M stock solution in isopropanol using special precautions 
Dimethyl sulfoxide  Sigma 6250
Dry ice or liquid nitrogene
Dulbecco's phosphate-buffered saline  ThermoFisher 14190094 or equivalent
Easy 50 EasySep Magnet  Stemcell 18002 for holding 1 x 50ml conical tube
EasySep Direct Human Neutrophil Isolation Kit  Stemcell 19666 This contains Solutions called “Isolation Cocktail” and “RapidSpheres magnetic beads
EGTA Sigma E3889
Eppendorf centrifuge 5417R centrifuge Eppendorf
Ethanol, in spray bottle
Ethylenediaminetetraacetic acid  Sigma E6758
Ice
Isopropanol (anhydrous grade)  Sigma 278475
Lysis buffer (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 1%(v/v) Triton X-100, 1 mM EGTA, 1 mM Na3VO4, 50 mM NaF, 10 mM β-glycerophosphate, 5 mM sodium pyrophosphate, 0.27 M sucrose, 0.1% (v/v) β-mercaptoethanol, 1x cOmplete(EDTA-free) protease inhibitor cocktail (Roche), 1 μg/ml Microcystin-LR, 0.5 mM diisopropylfluorophosphate (DIFP).  alternatively frozen lysis buffer in aliquots without Microcystin-LR, DIFP available from MRC-PPU Reagents (http://mrcppureagents.dundee.ac.uk/)
Merck LRRK2 inhibitor II (MLi-2) Merck 438194-10MG or equivalent (potent and selective LRRK2 inhinitor)
Microcystin-LR Enzo Life Sciences ALX-350-012-M001 1 mg/ml stock in DMSO and store at -80 oC. 
Na3VO4 Aldrich 450243
NaF Sigma S7920
Odyssey CLx scan Western Blot imaging system Odyssey
Permanent marker pen
Personal protection equipment
RPMI 1640 Medium  ThermoFisher 21875034 or equivalent
sodium pyrophosphate Sigma S22
sucrose Sigma S0389
β-glycerophosphate Sigma 50020
β-mercaptoethanol Sigma M3148
Suggested antibodies for Western blotting
Anti-RAB10 (phospho T73) antibody [MJF-R21] abcam ab230261
Anti-α-tubulin Cell Signaling Technologies 5174 used at 1:2000 dilution
Goat anti-mouse IRDye 680LT LI-COR 926-68020 used at 1:10,000 dilution
Goat anti-mouse IRDye 800CW LI-COR 926-32210 used at 1:10,000 dilution
Goat anti-rabbit IRDye 800CW LI-COR 926-32211 used at 1:10,000 dilution
MJFF-total Rab10 mouse antibody generated by nanoTools (nanotools.de) not applicable* used at 2 μg/ml final concentration; * The MJFF-total Rab10 antibody generated by nanoTools (www.nanotools.de) [11] will be commercialised by the Michael J Fox Foundation in 2018
Mouse anti-LRRK2 C-terminus antibody Antibodies Incorporated  75-253 used at 1 μg/ml final concentration
pS935-LRRK2 MRC PPU Reagents and Services UDD2 MJFF-total Rab10 mouse antibody

Referencias

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Fan, Y., Tonelli, F., Padmanabhan, S., Baptista, M. A., Riley, L., Smith, D., Marras, C., Howden, A., Alessi, D. R., Sammler, E. Human Peripheral Blood Neutrophil Isolation for Interrogating the Parkinson’s Associated LRRK2 Kinase Pathway by Assessing Rab10 Phosphorylation. J. Vis. Exp. (157), e58956, doi:10.3791/58956 (2020).

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