JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Divulgaciones
Acknowledgements
Materials
Referencias
Traducción Automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Medicina

Akciğer yolu bulabilen insan lenfosit içinde deneysel bir alerjik iltihap ışık sayfalık mikroskobu üzerinde dayalı, Vivo modeli görüntüleme gelişmiş

Published: April 16, 2019
doi:
10.3791/59043
, , , , , ,
1Department of Medicine 1,University Hospital of Erlangen, 2Department of Medicine 3,University Hospital of Erlangen

Summary

Burada tanıtılan Protokolü içinde vivo inflamatuar koşullar altında birincil insan lenfosit akciğer izleme kapasitesini karakterizasyonu sağlar. Alerjik iltihap bir fare modeli adoptively transfer edilen insan bağışıklık hücrelerinin pulmoner infiltrasyon görüntüsü ve kimyasal olarak temizlenen Akciğer doku ışık sayfalık Floresans mikroskobu tarafından sayılabilir.

Abstract

Son derece aktif bağışıklık hücreleri doku birikimi ezici çeşitli kronik inflamatuar hastalıklar damgasını temsil eder ve çekici bir terapötik hedef etkilenen hastaların klinik yönetim olarak ortaya çıktı. Daha fazla patolojik olarak dengesiz doku infiltrasyonu pro-inflamatuar bağışıklık hücreleri tedavi düzenlenmesi nişan stratejileri iyileştirmek amacıyla bu gelişmiş anlayışlar içine hastalık ve organ özel ulaşmak için özellikle önem olacak Periferik lenfositler izleme özellikleri. Burada açıklanan deneysel protokol fluorescently etiketli ve adoptively transfer edilen insan lenfosit bağlamında papain kaynaklı akciğer iltihabı, akciğer birikimi izlemek için izin verir. Bağışıklık hücre göç ve kemotaksisi analizi için sık kullanılan standart tüp bebek deneyleri aksine şimdi tanıtılan içinde vivo hesap akciğer özgü yönlerini doku organizasyon ve karmaşık inflamatuar etkisi çıkar canlı fare organizma meydana senaryo. Ayrıca, üç boyutlu kesit ışık sayfalık Floresans mikroskobik görüntüleme sadece Nicel veri bağışıklık hücrelerinin infiltre sağlamaz ama aynı zamanda bağışıklık hücre yerelleştirme iltihaplanmış akciğer içinde desen gösteriyor. Genel olarak, biz yüksek değeri sağlanan adım adım iletişim kuralı takip ederek kolayca uygulanabilir kronik inflamatuar akciğer hastalıkları alanında immünolojik araştırma için yeni bir teknik tanıtmak edebiliyoruz.

Introduction

Klasik enflamatuar bozuklukları gibi Alerjik astım ve kronik obstrüktif akciğer hastalığı (KOAH), akciğerin Akciğer doku1,2aktive lenfositler artan bir işe tarafından yönlendirilmesi için bilinen. Lenfosit yayımlanan sitokinler (örneğin, Il-4, IL-5, IL-9, IL-13, IFN γ ve TNF-α) daha fazla kemotaksisi doğuştan gelen ve edinilmiş bağışıklık hücrelerinin desteklemek, fibrotik hava yolu remodeling teşvik veya doğrudan zarar akciğer parankimi2. Şimdiye kadar akciğer dokusu içinde lenfositler patolojik birikimi sorumlu temel mekanizmaları henüz tam olarak anlaşılır değil. Gut ve cilt giriş için açıklanan doku-seçici T hücre sürecinden için cümle içinde pulmoner dendritik hücreler (DC) üzerinde Periferik T hücre için tercihli akciğer infiltrasyonu, en azından kısmen CCR4 ifade indüksiyon yoluyla Başbakan belli ki edebiliyoruz yüzey lenfositler3. CCR4 yanı sıra, hava yolu infiltre T hücreleri da Kemokin reseptörlerinin CCR5 ve CXCR3 T hücrelerinin periferik kan1,4,5içinde karşılaştırıldığında özellikle artan bir ifade ile karakterizedir. Genel olarak, varolan veri akciğer posta fizyolojik veya inflamatuar koşullar altında T lenfositlerin farklı Kemokin reseptörleri ve onların anılan sıraya göre ligandlar, içerir ve bu nedenle en önemlisi üzerinde bağlıdır konsepti ile tutarlı bir yakından Doğuştan gelen ve edinilmiş bağışıklık hücreleri1arasında işbirliği kontrol. Özellikle, patojen veya alerjen pozlama başlangıç aşamasında TLR stimülasyon veya derhal serbest bırakılmasını LTB4, CCL1, CCL17 gibi farklı chemoattractants tarafından IgE aracılıklı cross-linking doğuştan gelen bağışıklık sistemi hücrelerinin yanıt, CCL22, CCL20, CXCL10 ve PGD21,6,7. Bir ilk örnek olarak PGD2 chemoattractant reseptör etkileşimini CRTh2 kemotaksisi Th2 hücrelerinin için özel öneme sahip olduğu bilinmektedir ve böylece astım klinik yönetim olarak umut verici terapötik hedef ortaya çıktı. Gerçekten de, orta astımı olan hastaların bir iyileşme belirtileri ve tedavi sonrası bir saniye (FEV1) zorunlu Ekspiratuar hacminin önemli bir artış ile plasebo grubu8 ‘ e göre bir seçici CRTh2 antagonisti gösterdi ,9. Bir daha ilerledi inflamatuar yanıt, zaten işe T hücreleri daha da pulmoner lenfosit birikimi yolu ile belgili tanımlık serbest bırakmak Il-4 ve IL-13 olarak güçlü bir çekim gücü pulmoner DCs için yükseltmek mümkün durumdadır. Daha sonra bu elde edilen Miyeloid doğuştan gelen hücreler yukarı-CCL17 ve CCL22 ifade STAT6 bağlı bir şekilde1,10,11düzenler.  Açıklanan senaryo karmaşıklığı hala T hücre akciğer homing tam bir anlayış engel rağmen enflamatuar veya Alerjik göğüs hastalıkları potansiyel olarak en iyi duruma getirilmiş bir tedavi kontrolü için moleküler hedeflerin bir bolluk sunmaktadır. Bu nedenle, daha da derinleştirmek ve bilgimizi T hücre kemotaksisi ve akciğer posta alanında tamamlayıcı edebiliyoruz yenilikçi deneysel teknikleri acil ihtiyaç yoktur.

Akciğer posta lenfositler insan vücudu içinde birden çok hücresel, humoral ve fiziksel parametrelerini1tarafından etkilenir nedeniyle gerçeğini, varolan deneysel yöntemlerin çoğu immünolojik bu işlem tüm karmaşıklığına modellemek mümkün değildir. Bunun yerine, seçmeli olarak homing akciğer analizi için birçok standart protokolleri belirli bir yönü lenfosit cazibe, adezyon, geçiş ve kalıcılık çağlayan dahil odaklanmak. Yanı sıra tamamen tasvir tayini periferik veya akciğer infiltre lenfositler üzerinde integrinler ve Kemokin reseptörlerinin mRNA veya protein ifade deseni ve kan, ilgili Kemokin düzeyleri tamamlayıcı ölçümü bronchoalveolar lavaj (BAL) ya da akciğer doku12,13,14,15, köklü in vitro hücre kültürü deneyleri lenfosit yapışma veya kemotaksisi işlevsel bir karakterizasyonu izin ver üzerine deneysel koşullar16,17,18tanımlı. Prensip olarak, statik içinde vitro yapışma deneyleri bir endotel monolayer veya rekombinant endotel adezyon molekülleri (örneğin, MAdCAM-1, VCAM-1), kaplamalı cam slaytlara kültürlü lenfositlerin Bağlama kapasitesi standart tüp bebek izlemek kemotaksis deneyleri genellikle bir transwell sistemi19Kemokin Gradyanda birlikte geçirmek için yeteneği lenfositlerin ölçmek için uygulanır. Tüp Bebek her iki ayar kontrollü ayarlama ve modülasyon deneysel koşullar etkinleştirir ancak öte yandan önemli değişkenler eleştirel içinde vivo kemotaksisi ve lenfositlerin adezyon etkisi bilinen eksikliği. Ağırlıklı olarak, statik hücre kültürü deneyleri kalıcı kan akışı19 tarafından neden kesme Kuvvetleri etkisi göz ardı ve potansiyel olarak çevredeki immünolojik çevre ve etkileşen lenfosit bağışıklık hücreleri katılımı ihmal, ikisi de canlı bir organizma. Bu sınırlamalarının üstesinden gelir için statik tüp bebek kemotaksisi veya bağlılık deneyleri içinde alınan sonuçları yorumlanması gerekir daha fazla doğrulama dinamik yapışma deneylerde akışı koşulları20,21 altında ve inç içinde vivo modelleri inflamatuar organ patoloji19. Gerçekten de, önemli sonuçlara T hücre akciğer iltihabi veya Alerjik koşullarda homing düzenlenmesinde hayvan çalışmaları çekilmiş olabilir genetik analiz tanımlanmış modeller farklı göğüs hastalıkları3, farelerde değiştirilme tarihi 22 , 23. köklü ve genel olarak kullanılan bir araç belirli hücresel etkisini tanımlamak için belirli bir gen ilgi temsil ettiği için wildtype fareler ve fareler bir eksikliği olan arasında lenfositler infiltre akciğer nicel karşılaştırılması yollar veya hastalık odaklı model T hücre dağıtım üzerinde reseptörleri. Ancak, aksine in vitro hücre kültürü deneyleri, tartışılan önce klasik hayvan modelleri alan bir çalışma tasarım analiz ve birincil insan T hücreleri doğrudan kan veya hastaların bir inflamatuar akciğer acı BAL elde izlemek için yeteneği yoksun hastalık. Böylece, işlevsel olarak bir tanıyla belirtilen akciğer hastalığı için tercihli akciğer tropism ve ne kadar klinik parametreler bu senaryo üzerinde etkisi olabilir insan lenfosit Künye mümkün olup olmadığını doğrulamak için zorlu kalıyor. Son zamanlarda, çok zarif bir içinde vivo yaklaşım bağlamında bu sınırlamaların çoğunu aşmak başardı ve bağırsak lenfosit24 homing üzerinde gelişmiş translasyonel çalışmalar için yeni yollar açtı, iltihabi bağırsak hastalıkları (IBD), tanıtıldı . Solvent bazlı doku takas kesitsel ışık sayfalık Floresans mikroskobu güçlü görüntüleme aracı olarak ardından protokollerde yararlanarak, infiltrasyon ve dağıtım adoptively transfer edilen insan T hücrelerinin görselleştirmek mümkün colitic immünyetmezligi fareler24bağırsaklarda. Özellikle, uygulanan bu deneysel ayarı iki ana yenilikler: (1) birincil insan bağışıklık hücreleri analiz deneysel olarak tanımlanmış içinde vivo koşullarda; (2) bir büyükçe alanı hastalıklı organ (yaklaşık 1,5 cm x 1,5 cm) 3D-imar tarafından takip yüksek çözünürlük kalitesinde görüntüsü. Ayrıca, birkaç son yıllarda yapılan çalışmalarda başarılı solvent bazlı doku takas ve ışık sayfalık Floresans mikroskobu kullanımı gelişmiş akciğer25,26görüntüleme için önemli araçlar olarak kurdu. Bu teknolojik ilerlemeden pulmoner İmmünoloji alanında faydalanmak için şimdi akciğer posta analiz için sistem evlat edindik.

Burada sunulan Protokolü nasıl arındırmak ve fluorescently birincil insan T transfer içine indüklenen akciğer iltihabı ile fareler için hücreleri ve ayrıca, ışık sayfalık sonraki süreci ayrıntılı olarak açıklayan etiket adım adım bir giriş niteliğindedir. Floresans mikroskobik görüntüleme, organ hazırlık ve görüntü işleme de dahil olmak üzere. Genel olarak, karmaşık, ama yine de mümkün, deneysel model insan lenfosit akciğer posta içinde vivo koşulları üzerine izleme tanıtarak enflamatuar veya Alerjik akciğer hastalıkları alanında gelecek translasyonel çalışmaları desteklemek umuyoruz.

Protocol

Deney hayvanları içeren Erlangen (Regierung von Unterfranken, Würzburg, Almanya) ilgili yerel yetkilileri tarafından onaylanmış protokoller uyarınca gerçekleştirilmiştir. Fareler patojen-Alerjik belirli koşullar altında muhafaza. İnsan kanı topluluğu yerel etik kurul ve üniversite Erlangen-Nürnberg, Kurumsal değerlendirme Komitesi tarafından kabul edildi. Her hastanın yazılı onay verdi. 1. neden Alerjik akciğer iltihabı farelerde Not:</…

Representative Results

Sunulan Protokolü izleme ve ışık sayfalık Floresans mikroskobu ile akciğer adoptively transfer edilen insan T lenfositler birikimi miktarının sağlar bir deneysel fare modeli açıklar. Resim 1 A deneysel zamanlama içinde vivo adımlardan şematik bir genel bakış sağlar. Güvenilir sonuçlar sağlamak için o izole ve fluorescently iyi kalite sağlamak için önemli önemi insan CD4 etiketli+ T hücreleri, daha sonra fareler aktarılır. <strong class…

Discussion

Burada açıklanan deneysel ayarı içinde vitro yapışma ve kemotaksisi birincil insan bağışıklık hücreleri içinde vivo inflamatuar koşulları ve böylece relevantly tamamlar altında akciğer izleme kapasitesini klasik izlemek için fırsat gerçekleştirilen sağlar deneyleri. Akciğer hesap belirli anatomik organ özellikleri almak için bağışıklık hücre (dahil kemotaksisi ve hücre dağıtım hedef organ içinde) yanı sıra klinik önemi ve lisans alınan veri transferi h…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar DFG işbirlikçi araştırma merkezleri SFB 1181 ve TRR 241 tarafından finansman minnetle kabul etmiş oluyorsunuz. Optik görüntüleme Merkezi Erlangen (anlatım) ve belirli Ralf Palmisano, Philipp Tripal ve Tina Fraaß (proje Z2, DFG CRC 1181) ışık sayfalık Floresans mikroskobik görüntüleme için uzman teknik destek için kabul vardır.

Materials

Agarose NEEO Ultra Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany 2267.4
AlexaFlour594 anti-human CD45 antibody BioLegend, San Diego, USA 304060
Ammonium chloride Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany K2981
Cannula 21 G Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA 301300
Cell proliferation dye eflour670 eBioscience Inc., San Diego, USA 65-0840-85
CD4 MicroBeads, human Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany 130-045-101
EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany 8043.1
Potassium-EDTA blood collection tube, 9 ml Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany 21066001
Ethly cinnamate (ECi) Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany 112372-100G
Ethanol ≥ 99.5 % (EtOH) Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany 5054.3
FBS (fetal bovine serum) Good Forte PAN-Biotech GmbH, Aidenbach, Germany P40-47500
Filter 100 µm  VWR International Germany GmbH, Darmstadt, Germany 732-2758
Imaris Image Analysis Software 9.0.2 Bitplane AG, Zurich, Switzerland n.a.
ImspectorPro software Abberior Instruments GmbH, Göttingen, Germany n.a.
Ketamin  Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Germany 3617KET-V
LaVision UltraMicroscope II LaVision BioTec GmbH, Bielefeld, Germany n.a.
MACS MultiStand Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany 130-042-303
Multifly cannula 20 G Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany 851638035
30 G needle B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Hessen, Germany 9161502
Neubauer counting chamber neoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany C-1003
Pattex Glue Henkel AG & Co, Düsseldorf, Germany PSK1C
LS column Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany 130-042-401
Lymphocyte Separation Media (Density 1,077 g/ml) anprotec AC-AF-0018
RPMI medium  (Gibco) Life Technologies GmbH,
Darmstadt, Germany 61870-010
Papain Merck 1,071,440,025
PBS Dulbecco (phosphate buffered saline) Biochrom GmbH, Berlin, Germany L182-10
PerCP/Cy5.5 anti-human CD4 BioLegend, San Diego, USA 317428
PerCP/Cy5.5 mouse IgG2b, κ isotype Ctrl BioLegend, San Diego, USA 400337
PFA (paraformaldehyde) Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany 0335.1
Potassium hydrogen carbonate Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany P7481
Serological pipette 10 ml Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany 86.1254.001 
Syringe 1 ml B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Hessen, Germany 9166017V
Syringe 5 ml Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA 260067
Syringe 20 ml Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA 260069
Tube 1.5 ml Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany 72,706,400
Tube 2 ml Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany 72.695.400 
Tube 2 ml, brown Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany 72,695,001
Tube 15 ml Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany 62.554.502 
Tube 50 ml Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany 62.547.254 
QuadroMACS Separator Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany 130-090-976
Xylazin (Rompun 2%) Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany KPOBD32
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referencias

  1. Medoff, B. D., Thomas, S. Y., Luster, A. D. T cell trafficking in allergic asthma: the ins and outs. Annual Review of Immunology. 26, 205-232 (2008).
  2. Baraldo, S., Lokar Oliani, K., Turato, G., Zuin, R., Saetta, M. The Role of Lymphocytes in the Pathogenesis of Asthma and COPD. Current Medicinal Chemistry. 14 (21), 2250-2256 (2007).
  3. Mikhak, Z., Strassner, J. P., Luster, A. D. Lung dendritic cells imprint T cell lung homing and promote lung immunity through the chemokine receptor CCR4. Journal of Experimental Medicine. 210 (9), 1855-1869 (2013).
  4. Thomas, S. Y., Banerji, A., Medoff, B. D., Lilly, C. M., Luster, A. D. Multiple chemokine receptors, including CCR6 and CXCR3, regulate antigen-induced T cell homing to the human asthmatic airway. Journal of Immunology. 179 (3), 1901-1912 (2007).
  5. Katchar, K., Eklund, A., Grunewald, J. Expression of Th1 markers by lung accumulated T cells in pulmonary sarcoidosis. Journal of Internal Medicine. 254 (6), 564-571 (2003).
  6. Wu, Z., et al. Mast cell FcepsilonRI-induced early growth response 2 regulates CC chemokine ligand 1-dependent CD4+ T cell migration. Journal of Immunology. 190 (9), 4500-4507 (2013).
  7. Hart, P. H. Regulation of the inflammatory response in asthma by mast cell products. Immunology, Cell Biology. 79 (2), 149-153 (2001).
  8. Bice, J. B., Leechawengwongs, E., Montanaro, A. Biologic targeted therapy in allergic asthma. Annals of Allergy & Asthma & Immunology. 112 (2), 108-115 (2014).
  9. Barnes, N., et al. A randomized, double-blind, placebo-controlled study of the CRTH2 antagonist OC000459 in moderate persistent asthma. Clinical & Experimental Allergy. 42 (1), 38-48 (2012).
  10. Medoff, B. D., et al. CD11b+ myeloid cells are the key mediators of Th2 cell homing into the airway in allergic inflammation. Journal of Immunology. 182 (1), 623-635 (2009).
  11. Oeser, K., Maxeiner, J., Symowski, C., Stassen, M., Voehringer, D. T. T cells are the critical source of IL-4/IL-13 in a mouse model of allergic asthma. Allergy. 70 (11), 1440-1449 (2015).
  12. Freeman, C. M., Curtis, J. L., Chensue, S. W. CC chemokine receptor 5 and CXC chemokine receptor 6 expression by lung CD8+ cells correlates with chronic obstructive pulmonary disease severity. The American Journal of Pathology. 171 (3), 767-776 (2007).
  13. Kallinich, T., et al. Chemokine-receptor expression on T cells in lung compartments of challenged asthmatic patients. Clinical & Experimental Allergy. 35 (1), 26-33 (2005).
  14. Vasakova, M., et al. Bronchoalveolar lavage fluid cellular characteristics, functional parameters and cytokine and chemokine levels in interstitial lung diseases. Scandinavian Journal of Immunology. 69 (3), 268-274 (2009).
  15. Campbell, J. J., et al. Expression of chemokine receptors by lung T cells from normal and asthmatic subjects. Journal of Immunology. 166 (4), 2842-2848 (2001).
  16. Halwani, R., et al. IL-17 Enhances Chemotaxis of Primary Human B Cells during Asthma. PLoS One. 9 (12), 114604 (2014).
  17. Agostini, C., et al. Cxcr3 and its ligand CXCL10 are expressed by inflammatory cells infiltrating lung allografts and mediate chemotaxis of T cells at sites of rejection. The American Journal of Pathology. 158 (5), 1703-1711 (2001).
  18. Ainslie, M. P., McNulty, C. A., Huynh, T., Symon, F. A., Wardlaw, A. J. Characterisation of adhesion receptors mediating lymphocyte adhesion to bronchial endothelium provides evidence for a distinct lung homing pathway. Thorax. 57 (12), 1054-1059 (2002).
  19. Radeke, H. H., Ludwig, R. J., Boehncke, W. H. Experimental approaches to lymphocyte migration in dermatology in vitro and in vivo. Experimental Dermatology. 14 (9), 641-666 (2005).
  20. Miles, A., Liaskou, E., Eksteen, B., Lalor, P. F., Adams, D. H. CCL25 and CCL28 promote alpha4 beta7-integrin-dependent adhesion of lymphocytes to MAdCAM-1 under shear flow. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 294 (5), 1257-1267 (2008).
  21. Zundler, S., et al. The alpha4beta1 Homing Pathway Is Essential for Ileal Homing of Crohn’s Disease Effector T Cells In vivo. Inflammatory Bowel Diseases. 23 (3), 379-391 (2017).
  22. Verbist, K. C., Cole, C. J., Field, M. B., Klonowski, K. D. A role for IL-15 in the migration of effector CD8 T cells to the lung airways following influenza infection. Journal of Immunology. 186 (1), 174-182 (2011).
  23. Kopf, M., Abel, B., Gallimore, A., Carroll, M., Bachmann, M. F. Complement component C3 promotes T-cell priming and lung migration to control acute influenza virus infection. Nature Medicine. 8 (4), 373-378 (2002).
  24. Zundler, S., et al. Three-Dimensional Cross-Sectional Light-Sheet Microscopy Imaging of the Inflamed Mouse Gut. Gastroenterology. 153 (4), 898-900 (2017).
  25. Mzinza, D. T., et al. Application of light sheet microscopy for qualitative and quantitative analysis of bronchus-associated lymphoid tissue in mice. Cellular & Molecular Immunology. , (2018).
  26. Erturk, A., Lafkas, D., Chalouni, C. Imaging cleared intact biological systems at a cellular level by 3DISCO. Journal of Visualized Experiments. (89), 51382 (2014).
  27. Morita, H., et al. An Interleukin-33-Mast Cell-Interleukin-2 Axis Suppresses Papain-Induced Allergic Inflammation by Promoting Regulatory T Cell Numbers. Immunity. 43 (1), 175-186 (2015).
  28. Mann, L., Klingberg, A., Gunzer, M., Hasenberg, M. Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (123), 55450 (2017).
  29. Mercer, R. R., et al. Extrapulmonary transport of MWCNT following inhalation exposure. Particle and Fibre Toxicology. 10, 38 (2013).
  30. Minton, C., et al. Demonstration of microvessel networks and endothelial cell phenotypes in the normal murine lung. Journal of Nippon Medical School. 72 (6), 314-315 (2005).
  31. Van Hoecke, L., Job, E. R., Saelens, X., Roose, K. Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration. Journal of Visualized Experiments. (123), 55398 (2017).
  32. Fischer, A., et al. Differential effects of alpha4beta7 and GPR15 on homing of effector and regulatory T cells from patients with UC to the inflamed gut in vivo. Gut. 65 (10), 1642-1664 (2016).
  33. Shultz, L. D., Ishikawa, F., Greiner, D. L. Humanized mice in translational biomedical research. Nature Reviews Immunology. 7 (2), 118-130 (2007).
  34. Brehm, M. A., Jouvet, N., Greiner, D. L., Shultz, L. D. Humanized mice for the study of infectious diseases. Current Opinion in Immunology. 25 (4), 428-435 (2013).
  35. Wege, A. K. Humanized Mouse Models for the Preclinical Assessment of Cancer Immunotherapy. BioDrugs. , (2018).
  36. Jespersen, H., et al. Clinical responses to adoptive T-cell transfer can be modeled in an autologous immune-humanized mouse model. Nature Communications. 8 (1), 707 (2017).
  37. Schloder, J., Berges, C., Luessi, F., Jonuleit, H. Dimethyl Fumarate Therapy Significantly Improves the Responsiveness of T Cells in Multiple Sclerosis Patients for Immunoregulation by Regulatory T Cells. International Journal of Molecular Sciences. 18 (2), (2017).
  38. Murdoch, C., Finn, A. Chemokine receptors and their role in inflammation and infectious diseases. Blood. 95 (10), 3032-3043 (2000).
  39. Rivera-Nieves, J., Gorfu, G., Ley, K. Leukocyte adhesion molecules in animal models of inflammatory bowel disease. Inflammatory Bowel Diseases. 14 (12), 1715-1735 (2008).
  40. Zundler, S., Neurath, M. F. Novel Insights into the Mechanisms of Gut Homing and Antiadhesion Therapies in Inflammatory Bowel Diseases. Inflammatory Bowel Diseases. 23 (4), 617-627 (2017).
  41. Halim, T. Y., Krauss, R. H., Sun, A. C., Takei, F. Lung natural helper cells are a critical source of Th2 cell-type cytokines in protease allergen-induced airway inflammation. Immunity. 36 (3), 451-463 (2012).
  42. Kamijo, S., et al. IL-33-mediated innate response and adaptive immune cells contribute to maximum responses of protease allergen-induced allergic airway inflammation. Journal of Immunology. 190 (9), 4489-4499 (2013).
  43. Milne, J., Brand, S. Occupational asthma after inhalation of dust of the proteolytic enzyme, papain. British Journal of Industrial Medicine. 32 (4), 302-307 (1975).
  44. Klingberg, A., et al. Fully Automated Evaluation of Total Glomerular Number and Capillary Tuft Size in Nephritic Kidneys Using Lightsheet Microscopy. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452-459 (2017).
  45. Ariel, P. A beginner’s guide to tissue clearing. The International Journal of Biochemistry, Cell Biology. 84, 35-39 (2017).
  46. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
  47. Looney, M. R., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nature Methods. 8 (1), 91-96 (2011).
  48. Looney, M. R., Bhattacharya, J. Live imaging of the lung. Annual Review of Physiology. 76, 431-445 (2014).
  49. Lefrancais, E., et al. The lung is a site of platelet biogenesis and a reservoir for haematopoietic progenitors. Nature. 544 (7648), 105-109 (2017).
  50. Headley, M. B., et al. Visualization of immediate immune responses to pioneer metastatic cells in the lung. Nature. 531 (7595), 513-517 (2016).
  51. Hammad, H., et al. House dust mite allergen induces asthma via Toll-like receptor 4 triggering of airway structural cells. Nature Medicine. 15 (4), 410-416 (2009).
  52. Bose, O., et al. Mast cells present protrusions into blood vessels upon tracheal allergen challenge in mice. PLoS One. 10 (3), 0118513 (2015).
  53. Galkina, E., et al. Preferential migration of effector CD8+ T cells into the interstitium of the normal lung. Journal of Clinical Investigation. 115 (12), 3473-3483 (2005).

Tags

Keywords: Lung HomingHuman LymphocytesAllergic InflammationLight-sheet MicroscopyT Cell Lung HomingInflammatory Lung DiseasesPapainFicollPBMCCD4+ T CellsCell Proliferation DyeAdoptive Transfer
check_url/es/59043?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artículo
Schulz-Kuhnt, A., Zundler, S., Grüneboom, A., Neufert, C., Wirtz, S., Neurath, M. F., Atreya, I. Advanced Imaging of Lung Homing Human Lymphocytes in an Experimental In Vivo Model of Allergic Inflammation Based on Light-sheet Microscopy. J. Vis. Exp. (146), e59043, doi:10.3791/59043 (2019).
Descargar cita
Reimpresiones y permisos

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image