Évaluation des paramètres de la neuroplasticité ultrastructurales après In Utero Transduction du cerveau de souris et la moelle épinière en développement
Summary
La combinaison de la microscopie électronique à transmission et transduction in utero est une approche puissante pour l’étude des changements morphologiques dans l’ultrastructure fine du système nerveux au cours du développement. Cette méthode combinée permet profond aperçu des changements dans les détails structurels qui sous-tendent la neuroplasticité en ce qui concerne leur représentation topographique.
Abstract
La présente étude combine la transduction in utero par microscopie électronique à transmission (TEM) visant à une analyse morphométrique précis des paramètres ultrastructurales dans des structures topographiques clairement identifiés, touchés par une protéine d’intérêt qui est introduit dans l’organisme par l’intermédiaire de transfert viral. Cette approche combinée permet une transition sans heurt entre macrostructuraux ultrastructurale identification par cartes topographiques navigation suivantes dans un atlas de tissu. La microscopie électronique à haute résolution du tissu in-utero-transduites révèle l’ultrastructure fine de la neuropile et ses paramètres de plasticité, tels que les zones transversales bouton synaptique, le nombre de vésicules synaptiques et les mitochondries dans un profil de bouton, la longueur des contacts synaptiques, zones axonales transversales, l’épaisseur de la gaine de myéline, le nombre de lamelles de la myéline et des zones transversales des profils de mitochondries. L’analyse de ces paramètres révèle les idées essentielles de l’évolution de la plasticité ultrastructurale dans les domaines du système nerveux qui sont concernés par le transfert viral de la construction génétique. Cette méthode combinée peut non seulement être utilisée pour l’étude de l’effet direct des biomolécules génétiquement et/ou de médicaments sur la plasticité neuronale, mais ouvre également la possibilité d’étudier le sauvetage dans l’utérus de la plasticité neuronale (par exemple, dans le cadre de maladies neurodégénératives).
Introduction
Aucun photon ne peut pénétrer un spécimen de tissu ultraminces dans le grade de profondeur d’un électron. Cela attribue des avantages inestimables à TEM à capter des images de résolution nanométrique de structures fines par rapport à des techniques de microscopie optique. Par exemple, permet la visualisation des organites intracellulaires comme les mitochondries, mélanosomes et divers types de granules de sécrétion, les microtubules, microfilaments, cils, microvillosités et jonctions intercellulaires (surface de la cellule TEM des spécialisations), en particulier de synapses dans le système nerveux1,2,3,4. L’objectif global de la présente étude méthodologique est la reconnaissance ultrastructurale des changements dans la plasticité neuronale au cours du développement à interférence prénatale en combinant les techniques de l’état-of-the-art de transduction in utero et TEM. Virally protéines d’intérêt ont été transduites in utero dans le système nerveux central5,6,7, y compris la moelle épinière6. Par exemple, transduction in utero en combinaison avec le TEM a été utilisée pour étudier l’effet de la molécule d’adhésion cellulaire L1 sur moteur d’apprentissage plasticité chez les souris déficientes en L1, en particulier en ce qui concerne l’interaction entre la L1 et protéines de récepteurs nucléaires dans les neurones cérébraux7.
L’analyse des paramètres de la neuroplasticité exige des informations précises sur la localisation des zones plus petites au sein du système nerveux. Par conséquent, il est adéquat décrire les détails ultrastructurales et leur orientation topographique exacte en ce qui concerne les autres structures. Dans la présente étude, on présente une méthode de préparatoire spécifique visant à l’étude détaillée des aires morphologiques distinctes basées sur la lumière et la microscopie électronique. Cette approche combine plusieurs techniques de manipulation des tissus, à partir de transduction in utero du cerveau de souris et de la moelle épinière et suivie de la fixation de la perfusion, enrobage moule et le traitement du tissu pour TEM. Une étape essentielle, comprise entre l’intégration et le traitement du tissu pour TEM est la documentation du tissu, en utilisant la technique de réflexion de la lumière d’interférence qui permet de documentation microphotographique et faible grossissement précise de tissu spécimens8,9,10. Incorporé à l’approche actuelle, cette technique permet aux chercheurs d’examiner les détails topographiques et structurelles des surfaces de tissus du système nerveux et des profils de tranche de spécimen avant leur préparation pour TEM.
Un cadre exceptionnel pour le cerveau entier de sectionnement correspond aux coordonnées stéréotaxiques. Ce châssis bénéficie de la reconstruction morphologique de (3D) en trois dimensions des zones dans le tissu nerveux et peut être utilisé pour l’analyse morphométrique. Les macrographs des sections visualisées sont assignés coordonnées topographiques et les sections numérotées construire des cartes dans un atlas de tissu.
Après résine de traitement, le tissu embarqué est sectionné en coupes ultrafines (< 70 nm) contenant des zones sélectionnées, selon les cartes de l’atlas de tissus mentionnés ci-dessus. Les sections ultra-minces sont soumises à des TEM d’obtenir des images haute résolution des paramètres (par exemple, section profil zones de boutons synaptiques ou fibres axonales) de la plasticité de leur contenu et des contacts aux structures voisines au sein du complexe neuropile.
Avec la méthode décrite ici, la transition sans heurt entre les macrostructures visualisées micro et nanostructures permet des études comparatives approfondies de la plasticité neuronale morphologique après in utero transduction des pays en développement nerveuse système.
Protocol
Representative Results
Discussion
Une étape cruciale de la transduction in utero est la procédure d’injection. L’injection précise dans les ventricules cérébraux ou dans un autre domaine d’intérêt nécessite l’expérience et les compétences pratiques. Le diluant l’astuce microcapillaire, moins les dommages de tissu peuvent se produire ; Cependant, c’est au détriment de l’augmentation de pression d’injection. Contrairement à l’électroporation in utero19,20,…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient les collègues de l’animalerie à la faculté de médecine, Université de la Ruhr de Bochum, pour leurs soins de soutien et des animaux.
Materials
| 2,4,6-Tris(dimethyl-aminomethyl)phenol | Serva | 36975 | |
| 26Gx 1'' needle | Henke-Sass, Wolf GmbH | ||
| 410 Anaesthesia Unit for air pump | Biomedical Instruments (Univentor) | 8323102 | |
| Adeno-associated virus serotype 1 (AAV1) | UKE (Viral Core Facility) | – | For references and target areas of AAV1 see: https://www.addgene.org/viral-vectors/aav/aav-guide/ and also: Designer gene delivery vectors: molecular engineering and evolution of adeno-associated viral vectors for enhanced gene transfer. Kwon I, Schaffer DV. Pharm Res. 2008 Mar;25(3):489-99. Recombinant AAV viral vectors pseudotyped with viral capsids from serotypes 1, 2, and 5 display differential efficiency and cell tropism after delivery to different regions of the central nervous system. Burger C, Gorbatyuk OS, Velardo MJ, Peden CS, Williams P, Zolotukhin S, Reier PJ, Mandel RJ, Muzyczka N. Mol. Ther. 2004 Aug;10(2):302-17. Self-complementary recombinant adeno-associated virus (scAAV) vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis. McCarty DM, Monahan PE, Samulski RJ. Gene Ther. 2001 Aug;8(16):1248-54. |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9414 | low gelling agarose |
| Air Pump | Biomedical Instruments (Univentor) | Eheim 100 | |
| Araldite | CIBA-GEIGY | 23857.9 | resin for embedding of tissue |
| aspirator tune assemblies | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | |
| Breathing Mask Mouse Anodized Aluminium | Biomedical Instruments (Univentor) | – | |
| buprenorphine | Temgesic | ampules | painkiller |
| capillaries | Science-Products | GB100TF-10 | with fillament |
| Dodecenylsuccinic anhydride | Fluka | 44160 | |
| Dumont tweezers (#3, 12 cm, straight, 0.2 x 0.12 mm) | FST | 11203-23 | |
| electric shaver | Phillips | – | |
| Ethicon sutures (Ethilon, 6-0 and 3-0) | Ethicon | – | polyamide |
| eye lubricant | Bepanthene | – | |
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7252 | for visualization of injected liquids |
| Gas Routing Switch 4/2 connectors | Biomedical Instruments (Univentor) | 8433020 | |
| halsted Mosquito hemostatic forceps (12.5 cm, straight) | FST | 13011-12 | |
| Heparin-Natrium | Ratiopharm | 25 000 I.E./5 ml | |
| Induction box for mice with horizontally moving lid. Inner dimensions: LxBxH: 155x115x130 mm. Wall thickness: 6 mm |
Biomedical Instruments (Univentor) | – | |
| iris forceps (10cm, curved, serrated) | FST | 14007-14 | |
| iris scissors (11cm, straight, tungsten carbide) | FST | 14501-14 | |
| Isofluran OP Tisch, electrically heated, sm Outer dimensions: 257x110x18 mm. Heating area: 190×90 mm The removal of the isoflurane escaping the breathing mask is downwards in compliance with the regulations |
Biomedical Instruments (Univentor) | – | |
| isoflurane (Attane) | JD medical | inhalation anesthesia | |
| LED RGB lights | Cameo | CLQS15RGBW | LEDs 2 x 15 W |
| Light microscope Basic DM E | Leica | – | 4x (N.A. 0.1 ∞/-), 10x (N.A. 0.22 ∞/0.17), 40x (N.A. 0.65 ∞/0.17), 100x (N.A. 1.25 ∞/0.17) objectives |
| micropipette puller | Science-Products | P-97 | |
| Mosquito hemostatic forceps (12.5cm, curved) | FST | 13010-12 | |
| Nickel grids, 200 mesh | Ted Pella | 1GC200 | |
| Osmium (VIII)-oxid | Degussa | 73219 | |
| Propylene oxide | Fluka | 82320 | |
| razor blades | Schick | 87-10489 | |
| Sodium pentobarbital (Narcoren) | Merial GmbH | – | |
| TC01mR 1-Channal temperature controller with feedback | Biomedical Instruments (Univentor) | – | |
| Technovit 4004 two components glue | Kulzer | ||
| Telemacrodevice | Canon | – | Canon Spiegelreflex Kamera EOS2000D, EF-S 18-55 mm f/3.5-5.6 IS STM Objective, Extension below 150 mm, Manual Extension Tube 7 mm ring, 14 mm ring, 28 mm ring, Macro reverse ring (58 mm), Canon copy stand. |
| Thermopuller P-97 | Sutter Instruments | – | |
| thin vibrating razor blade device | Krup | – | with Szabo thin blades |
| toluidine blue | Sigma-Aldrich | 89640 | |
| Transmission electron microscope C20 | Phillips | – | up to 200 kV |
| Tygon 6/4 Tubing material for connection of all parts Outer diameter: 6mm Inner diameter: 4mm Wa ll thickness: 1mm |
Biomedical Instruments (Univentor) | – | |
| Ultracut E | Reichert-Jung | – | ultramicrotome |
| Univentor Scavenger | Biomedical Instruments (Univentor) | 8338001 | |
| Vannas scissors (8 cm, straight) | FST | 15009-08 |
Referencias
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