通过后染色方法在聚丙烯酰胺凝胶中对芒果标记RNA的荧光可视化
Summary
在这里,我们提出了一种敏感、快速和鉴别的凝胶后染色方法,使用原生或变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)凝胶(PAGE)凝胶,将带有RNA芒果贴片I、II、III或IV标记的RNA成像。运行标准 PAGE 凝胶后,芒果标记的 RNA 可轻松与 TO1-Biotin 染色,然后使用常用的荧光读卡器进行分析。
Abstract
原生和变性聚丙烯酰胺凝胶通常分别用于表征核糖核蛋白(RNP)复杂流动性和测量RNA大小。由于许多凝胶成像技术使用非特异性污渍或昂贵的荧光探针,因此非常需要灵敏、鉴别和经济的凝胶成像方法。RNA芒果核心序列是小(19~22 nt)序列图案,当被任意RNA茎关闭时,可以简单而廉价地附着在感兴趣的RNA上。这些芒果标签与一种名为TO1-Biotin的硫磷-橙色荧光配体结合,具有高亲和力和特异性,结合后荧光会增加数千倍。在这里,我们表明芒果I,II,III和IV可用于在高灵敏度的凝胶中专门成像RNA。在原生凝胶中仅62.5 fmol和变性凝胶中125 fmol的RNA,可以通过在含有钾和20 nM TO1-Biotin的成像缓冲液中浸泡凝胶30分钟来检测。通过在总细菌RNA的复杂混合物中成像芒果标记的6S细菌RNA,我们证明了芒果标记系统的特异性。
Introduction
芒果是一个RNA标记系统,由一组四个小型荧光RNA贴合剂组成,与硫亚酮橙的简单衍生物(TO1-Biotin,图1A)1、2、3紧密结合( 纳米摩尔结合).结合后,这种配体的荧光会根据特定的贴合体增加1,000至4,000倍。芒果系统的高亮度,超过增强的绿色荧光蛋白(eGFP),结合RNA芒果贴合剂的纳米结合亲和力,使其可用于成像和RNA的纯化复合体 2,4。
芒果一号、第五号、二号、三号7的X射线结构已经确定为高分辨率,所有三个贴合体都利用RNA四联体结合TO1-Biotin(图1B+D)。所有三个贴实器的紧凑核心通过紧凑的适配器图案从外部RNA序列中分离出来。芒果I和II都利用灵活的GNRA环适配器将芒果芯连接到任意RNA双工(图1B,C)。相比之下,芒果III使用刚性三重体图案将其核心连接到任意RNA螺旋(图1D,紫色残留物),而芒果IV的结构目前尚不清楚。由于这些贴合剂的配体结合核心通过这些螺旋适配器从外部RNA序列中分离出来,因此它们似乎都可以简单地被合并到各种RNA中。细菌6S调节RNA(芒果I),酵母孢子菌(芒果I)的成分,以及人类5SRNA,U6RNA和C/D scaRNA(芒果II和IV)都成功地标记在这种方式2,8,这表明许多生物RNA可以使用RNA芒果贴切器系统进行标记。
变性和原生凝胶通常用于研究RNA。变性凝胶通常用于判断RNA大小或RNA处理,但通常,在北方斑点的情况下,需要几个缓慢和连续的步骤才能生成图像。虽然其他RNA致氟的贴合剂,如RNA菠菜和西兰花,已经成功地用于凝胶成像9,但迄今为止没有氟化贴合剂系统具有芒果系统的高亮度和亲和力,因此具有相当的兴趣调查芒果的凝胶成像能力在这项研究中,我们想知道RNA芒果系统是否可以简单地扩展到凝胶成像,因为TO1-Biotin的激发和发射波长(分别为510nm和535nm)适合在大多数荧光器常见的eGFP通道中成像凝胶扫描仪器。
此处介绍的凝胶后染色方案提供了一种快速方法,用于专门检测原生和变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE) 凝胶中的芒果标记 RNA 分子。这种染色方法涉及在含有钾和TO1-生物的缓冲液中浸泡凝胶。RNA芒果贴切剂以G-四重体为基础,需要钾来稳定这种结构。使用从最小的芒果编码DNA模板转录的RNA(参见协议部分),我们可以使用简单的染色方案,在原生凝胶中检测至多62.5 fmol的RNA和125 fmol的RNA。与常见的非特异性核酸污渍(见材料表,本文中引用SG),我们可以清楚地识别芒果标记的RNA,即使样品中存在高浓度的未标记总RNA。
Protocol
Representative Results
Discussion
芒果荧光标签的一个显著优点是单个标签可以多种方式使用。这些贴合剂的高亮度和亲和力使它们不仅可用于细胞可视化2,而且可用于体外RNA或RNP纯化4。因此,凝胶成像以简单明了的方式扩展了芒果标签的多功能性。芒果凝胶成像灵敏度略低于北方印贝14,但可以轻松检测60~120 fmol的RNA样品,无需冗长而繁琐的膜转移和探测步骤。这与之前在<sup clas…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者感谢拉兹万·科约卡鲁和阿米尔·阿卜杜拉赫扎德的技术援助,感谢莱娜·多尔戈舍纳对手稿进行校对。加拿大自然科学和工程研究理事会(NSERC)向P.J.U提供的业务赠款为该项目提供了资金。
Materials
| 0.8mm Thick Comb 14 Wells for 30 mL PAGE gels | LabRepCo | 11956042 | |
| 101-1000 µL tips | Fisher | 02-707-511 | |
| 20-200 µL low retention tips | Fisher Scientific | 02-717-143 | |
| Acrylamide:N,N'-methylenebisacrylamide (40% 19:1) | Bioreagents | BP1406-1 | Acute toxicity |
| Acrylamide:N,N'-methylenebisacrylamide (40% 29:1) | Fisher | BP1408-1 | Acute toxicity |
| Agar | Anachemia | 02116-380 | |
| Aluminium backed TLC plate | Sigma-Aldrich | 1164840001 | |
| Amersham Imager 600 | GE Healthcare Lifesciences | 29083461 | |
| Ammonium Persulfate | Biorad | 161-0700 | Harmful |
| BL21 cells | NEB | C2527H | |
| Boric Acid | ACP | B-2940 | |
| Bromophenol Blue sodium salt | Sigma | B8026-25G | |
| Chloloform | ACP | C3300 | |
| Dithiothreitol | Sigma Aldrich Alcohols | D0632-5G | |
| DNase I | ThermoFisher | EN0525 | |
| EDTA Disodium Salt | ACP | E-4320 | |
| Ethanol | Commerial | P016EAAN | |
| Flat Gel Loading tips | Costar | CS004854 | |
| Formamide 99% | Alfa Aesar | A11076 | |
| Gel apparatus set with spacers and combs | LabRepCo | 41077017 | |
| Glass Dish with Plastic lid | Pyrex | 1122963 | Should be large enough to fit your gel piece |
| Glycerol | Anachemia | 43567-540 | |
| HCl | Anachemia | 464140468 | |
| ImageQuanTL | GE Healthcare Lifesciences | 29000605 | |
| IPTG | Invitrogen | 15529-019 | |
| KCl | ACP | P-2940 | |
| MgCl2 | Caledron | 4903-01 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M3409 | |
| NaCl | ACP | S-2830 | |
| NaOH | BDH | BDH9292 | |
| Orbital Rotator | Lab-Line | ||
| Phenol | Invitrogen | 15513-039 | |
| Round Gel Loading tips | Costar | CS004853 | |
| Sodium Phosphate dibasic | Caledron | 8120-1 | |
| Sodium Phosphate monobasic | Caledron | 8180-01 | |
| SYBRGold | ThermoFisher | S11494 | |
| T7 RNA Polymerase | ABM | E041 | |
| TEMED | Sigma-Aldrich | T7024-50 ml | |
| TO1-3PEG-Biotin Fluorophore | ABM | G955 | |
| Tris Base | Fisher | BP152-500 | |
| Tryptone | Fisher | BP1421-500 | |
| Tween-20 | Sigma | P9496-100 | |
| Urea | Fisher | U15-3 | |
| Xylene Cyanol | Sigma | X4126-10G | |
| Yeast Extract | Bioshop | YEX401.500 |
Referencias
- Dolgosheina, E. V., et al. RNA Mango Aptamer-Fluorophore: A Bright, High-Affinity Complex for RNA Labeling and Tracking. ACS Chemical Biology. , (2014).
- Autour, A., et al. Fluorogenic RNA Mango aptamers for imaging small non-coding RNAs in mammalian cells. Nature Communications. 9, 656 (2018).
- Dolgosheina, E. V., Unrau, P. J. Fluorophore-binding RNA aptamers and their applications: Fluorophore-binding RNA aptamers. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. , (2016).
- Panchapakesan, S. S., et al. Ribonucleoprotein Purification and Characterization using RNA Mango. RNA. , 1592-1599 (2017).
- Trachman, R. J., et al. Structural basis for high-affinity fluorophore binding and activation by RNA Mango. Nature Chemical Biology. 13, 807 (2017).
- Trachman, R. J., et al. Crystal Structures of the Mango-II RNA Aptamer Reveal Heterogeneous Fluorophore Binding and Guide Engineering of Variants with Improved Selectivity and Brightness. Bioquímica. 57, 3544-3548 (2018).
- Trachman, R., et al. Mango-III is a compact fluorogenic RNA aptamer of unusual structural complexity. Nature Chemical Biology. , (2018).
- Panchapakesan, S. S. S., Jeng, S. C. Y., Unrau, P. J. RNA complex purification using high-affinity fluorescent RNA aptamer tags. Annals of the New York Academy of Sciences. , (2015).
- Filonov, G. S., Kam, C. W., Song, W., Jaffrey, S. R. In-gel imaging of RNA processing using Broccoli reveals optimal aptamer expression strategies. Chemistry & Biology. 22, 649-660 (2015).
- Milligan, J. F., Groebe, D. R., Witherell, G. W., Uhlenbeck, O. C. Oligoribonucleotide synthesis using T7 RNA polymerase and synthetic DNA templates. Nucleic Acids Research. 15, 8783-8798 (1987).
- A Typical DNase I Reaction Protocol (M0303). NEB Available from: https://www.neb.com/protocols/1/01/01/a-typical-dnase-i-reaction-protocol-m0303 (2018)
- Sambrook, J., Russell, D. W. Purification of Nucleic Acids by Extraction with Phenol:Chloroform. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).
- Tuma, R. S., et al. Characterization of SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain: A Dye Optimized for Use with 300-nm Ultraviolet Transilluminators. Analytical Biochemistry. 268, 278-288 (1999).
- Streit, S., Michalski, C. W., Erkan, M., Kleeff, J., Northern Friess, H. Northern blot analysis for detection and quantification of RNA in pancreatic cancer cells and tissues. Nature Protocols. 4, 37-43 (2009).
- Ebhardt, H. A., Unrau, P. J. Characterizing multiple exogenous and endogenous small RNA populations in parallel with subfemtomolar sensitivity using a streptavidin gel-shift assay. RNA. 15, 724-731 (2009).
