Tumefaciens de la agrobacteria y rhizogenes de la agrobacteria-transformación mediada de la patata y la actividad de promotor de un Gene del Suberin por GUS Staining

Summary

Aquí, presentamos dos protocolos para transformar plantas de patata. La transformación Agrobacterium tumefaciens conduce a una planta transgénica completa mientras que la Agrobacterium rhizogenes produce transgénicas raíces pilosas en una sesión de tipo salvaje que puede ser auto propagado. Entonces detectamos actividad de promotor por tinción de las raíces transformadas de GUS.

Abstract

Agrobacterium SP., es uno de los métodos más utilizados para obtener plantas transgénicas, ya que tiene la capacidad de transferir e integrar su propio T-ADN en genoma de la planta. Aquí, presentamos dos sistemas de transformación para modificar genéticamente las plantas de papa (Solanum tuberosum). En la transformación de a. tumefaciens , hojas están infectadas, las células transformadas se seleccionan y se regenera una planta transformada completa nueva con fitohormonas en 18 semanas. En la transformación de a. rhizogenes , tallos son infectados por las bacterias de la inyección con una aguja, las nuevas raíces peludas transformadas emergidas se detectan usando un marcador fluorescente rojo y se eliminan las raíces no-transformado. En 5-6 semanas, la planta resultante es un compuesto de una sesión de tipo salvaje con raíces peludas transformadas completamente desarrolladas. Para aumentar la biomasa, las raíces pilosas transformadas pueden ser suprimidas y uno mismo-propagar. Aplicamos ambos métodos de transformación de Agrobacterium -mediado para obtener las raíces que expresan el gen reportero GUS conducido por un promotor de genes biosintéticos de suberina. El procedimiento de tinción GUS se proporciona y permite la localización celular de la inducción del promotor. En ambos métodos, las raíces de papa transformada demostraron la coloración en el suberized de la endodermis y exodermis y además, en las raíces de a. rhizogenes transformó la actividad de GUS GUS también se detectó en el surgimiento de raíces laterales. Estos resultados sugieren que a. rhizogenes puede ser una herramienta rápida alternativa para estudiar los genes que se expresan en las raíces.

Introduction

Aparte de interés económico, la generación de plantas transgénicas tiene su propia importancia en la investigación para demostrar la función última de los genes y a comprender mejor la fisiología de las plantas y el desarrollo. El más utilizado método de inserción de ADN de la planta es Agrobacterium-mediado transformación. Agrobacterium tumefaciens es capaz de generar agallas de corona en el tejido infectado de muchas especies de plantas por la acción de su plásmido inductor de tumor de (Ti). El plásmido contiene una región de ADN de T con un conjunto de genes que se integrará en el genoma de la planta e inducir diferenciación de tejido

Protocol

El protocolo de transformación de a. rhizogenes fue adaptado y modificado de cuerno et al⁷ y el genotipo probado fue S. tuberosum ssp. tuberosum (CV Désirée). El protocolo de transformación de a. tumefaciens fue adaptado y modificado de Banerjee et al²² y los genotipos probados fueron S. tuberosum ssp. tuberosum (CV Désirée) y S. tuberosum SSP. andigena. Los pasos principales de ambos procedimientos se resumen en la figura 1 y figura 2, respectivamente.

Nota: En todos los pasos del procedi....

Results

Agrobacterium rhizogenes -mediada por la transformación de la papa

En este manuscrito, se presenta el procedimiento paso a paso para obtener raíz transformada con a. rhizogenes . Figura 1 presenta un resumen del procedimiento, que en conjunto toma alrededor de 5-6 semanas (de la inyección de a. rhizogenes para obtener raíces peludas comple.......

Discussion

En Papa, el sistema más común para obtener plantas transgénicas completas estables utiliza la transformación por cepas de Agrobacterium tumefaciens que requieren organogénesis con fitohormonas exógenas. Aunque los protocolos de Agrobacterium base tiene el potencial para integrar el vector T-DNA secuencia²⁵, esta metodología es aún más fácil y menos costoso para transformar plantas de patata. Durante los últimos años, el interés en a. rhizogenes-transformación mediada ha .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetona	Panreac	1.310.071.21
Acetosiringona	Acros	115540050
Bomba de acuario	Prodac	MP350
Autoclave	Ragpa Strelimatic
Agar bacteriológico	Lab Conda	1800
BAP	> Duchefa	B0904
Extracto de carne de vacuno	Lab Conda	< p>1700
Armario de cultivo de plantas	Nuaire
Carbenicillina	Duchefa	> C0109
Cefotaxima sódico	Duchefa	C0111
DMSO	Merck	1029310161
Ecotron infors	HT	29378
Etanol	Merck	1.009.831.011
Tubo de halcón	Control tecnica	CFT011500
Ferricianato	Sigma	101001081
Ferrocianato	Sigma	100979088
Maternal (8,06 cm de diámetro y 11,3 cm de altura) y tapa de plástico para cultivo in vitro	Apiglass	ref16
GA3	Sigma	G7645
Gamborg B5 media	Duchefa	G0210
Gelrite	Duchefa	< p>G1101
Glucosa	Sigma	G5767
Kanamicina	Sigma	K1377
Leukopor	BSN Leucopor	BDF47467
Lupe	Wild-Heerbrugg	M420
Agitador magnético	Agimatic	7000243
MES hidratado	Sigma	M2933-25G
MgSO4	Panreac	131404
Microscopio	Olympus
Centrífuga de minufuga 5415R	Eppendorf
Murashige y Skoog media	Duchefa	M0254.0050
Na2HPO4	Panreac	131679
NAA	Duchefa	N0903
NaCl	Panreac	131659
NaH2PO4	Sigma	58282
NightSea Stereo	SFA Moonting Adapter
Parafilm <	p>Anorsa	PRFL-001-001
Peptona	Lab Conda	1616
Petri Placas (90 x 14)	Anorsa	200200
pHmetre	Crison	< p>
Fitotrón	Inkoa	RFTI-R5485
Agar vegetal	Duchefa	P1001
Refrigeratot	Liebherr Medline
Rifampicina	> Duchefa	R0146
Spectinomycin	Sigma	59007
Espectrofotómetro	Shimadzu
Placas cuadradas (120 x 120)	Deltalab	< p>200204
Estreptomicina	Sigma	S6501
Sacarosa	Panreac	131621
Cuchillas quirúrgicas	Swann-Morton	201
Aguja quirúrgica	NIPRO	015/0204
Triptone	Lab Conda	1612
Triton	Serva	37240
Unimax 1010 agitador	Heidolph
Vacío	Dinko
x-GlcA (ácido 5-Bromo-4-cloro-3-indoxil-beta-D-glucurónico, sal de sodio anhidra)	Biosynth	B-7398
Extracto de levadura	Lab Conda	1702.00
Zeatin ribósido	Sigma	> 1001042850