El nematodo Caenorhabditis elegans es un excelente modelo para disecar interacciones huésped-patógeno. Se describe aquí es un protocolo para infectar el gusano con los miembros de los estreptococos del grupo mitis y determinar la activación de la respuesta de estrés oxidativo contra H2O2 producido por este grupo de organismos.
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Artículo de método
Estudiar el estrés oxidativo causado por los estreptococos del grupo Mitis en Caenorhabditis elegans
En este artículo
Resumen
Resumen
Caenorhabditis elegans (C. elegans), un nematodo de vida libre, se ha convertido en un atractivo modelo para el estudio de las interacciones huésped-patógeno. El protocolo presentado utiliza este modelo para determinar la patogenicidad causada por los estreptococos del grupo mitis a través de la producción de H2O2. Los estreptococos del grupo mitis son una amenaza emergente que causan muchas enfermedades en humanos tales como bacteremia, endocarditis y celulitis orbitaria. Se describe aquí es un protocolo para determinar la supervivencia de estos gusanos en respuesta a H2O2 producido por este grupo de patógenos. Usando la codificación de skn-1 gen para un factor de transcripción de respuesta de estrés oxidativo, se muestra que este modelo es importante para la identificación de genes de host que están esenciales contra la infección estreptocócica. Además, está demostrado que la activación de la respuesta de estrés oxidativo se puede supervisar en presencia de estos patógenos utilizando una cepa de gusano reportero transgénicos, en la que SKN-1 está fusionada a la proteína verde fluorescente (GFP). Estos ensayos ofrecen la oportunidad de estudiar la respuesta de estrés oxidativo a H2O2 derivado de una fuente biológica como contraposición a exógeno agregado fuentes de oxígeno reactivo (ROS) las especies.
Introducción
Estreptococos del grupo mitis son humanos comensales de la cavidad bucofaríngea1. Sin embargo, estos organismos pueden escapar de este lugar y causar una variedad de enfermedades invasivas2. Las infecciones causadas por estos microorganismos incluyen bacteriemia, endocarditis y celulitis orbitaria2,3,4,5,6. Por otra parte, ellos surgen como agentes de infecciones del torrente sanguíneo en neutropénicos, inmunodeprimidos y pacientes con cáncer que han sufrido q....
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Protocolo
1. preparación de tus placas de Agar (Extracto de levadura de Todd-Hewitt)
- Para 1 L de media, agregue 30 g de polvo de Todd-Hewitt, 2 g de extracto de levadura y 20 g de agar a un matraz de Erlenmeyer de 2 L. Agregar 970 mL de agua desionizada para el contenido del matraz e incluir una barra de agitación. Autoclave de los medios de comunicación a una temperatura de 121 ° C y presión de 15 lb/pulgada2 por 30 min. Después de eso, establecer los medios de comunicación en una placa de agitación y permiten para enfriamiento con agitación suave.
- Vierta los medios de comunicación en platos de Petri estériles tamaño adecuado (platos de 100 mm x ....
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Resultados
Grupo de miembros de la mitis S. mitis, S. oralis y S. gordonii rápidamente mataron a los gusanos, a diferencia de S. mutans, S. salivarius y no patógenas e. coli OP50 (figura 3A). La mediana de la supervivencia de S. mitisy S. oralis, S. gordonii era 300 min y 300 min min 345, respectivamente. Para determinar si el asesinato fue mediado por H2O2<.......
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Discusión
Los métodos descritos pueden ser utilizados para otras bacterias patógenas tales como Enterococcus faecium, que también produce H2O2 en anaerobios o microaerofílicos condiciones26. Por lo general, para más patógenos, lleva varios días a semanas para completar el análisis de supervivencia. Sin embargo, debido a la robusta producción de H2O2 por miembros del grupo mitis, estos ensayos podrían completarse dentro de 5-6 h en las condiciones descrita.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.
Agradecimientos
Agradecemos al Dr. Bing-Yan Wang, Dr. Gena Tribble (la Universidad de Texas, escuela de Odontología), Dr. Richard Lamont (Universidad de Louisville, Facultad de Odontología) y Dr. Samuel Shelburne (MD Anderson Cancer Center) laboratorio y cepas clínicas de los estreptococos del grupo mitis. También agradecemos a Dr. Keith Blackwell (Departamento de genética, escuela de medicina de Harvard) para las cepas de C. elegans . Finalmente, agradecemos a su laboratorio (la Universidad de Texas, escuela de medicina de McGovern) y Dr. Danielle Garsin para proporcionar reactivos y cepas de gusano para realizar el estudio. Algunas cepas de gusano fueron proporcionados por....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Medios y productos químicos | |||
| Agarosa | Sigma Aldrich | A9539-50G | |
| Bacto peptona | Fisher Scientific | DF0118-17-0 | |
| BD Bacto Todd Hewitt Caldo | Fisher Scientific | DF0492-17-6 | |
| BD BBL Sangre de oveja, desfibrinada | Fisher Scientific | B11947 | |
| BD Difco Agar | Fisher Scientific | DF0145-17-0 | |
| BD Difco LB Caldo | Fisher Scientific | DF0446-17-3 | |
| Agar sangre (TSA con sangre de oveja) | Fisher Scientific | R01200 | |
| Cloruro de calcio | Fisher Scientific | BP510-500 | |
| Carbenicillina | Fisher Scientific | BP26481 | |
| Catalase | Sigma Aldrich | C1345-1G | |
| Colesterol | Fisher Scientific | ICN10138201 | |
| IPTG | Fisher Scientific | MP21021012 | |
| Sulfato de magnesio | Fisher Scientific | BP213-1 | |
| Nistatina | Acros orgánicos | AC455500050 | |
| Fosfato de potasio Dibásico | Fisher Scientific | BP363-500 | |
| Fosfato de potasio monobásico | Fisher Scientific | BP362-500 | |
| Azida de sodio | Sigma Aldrich | S2002-25G | |
| Cloruro de sodio | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Hidróxido de sodio | Fisher Scientific | SS266-1 | |
| 8.25% Hipoclorito | |||
| Disulfato de sodio Dibasic | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Sulfato de estreptomicina | Fisher Scientific | BP910-50 | |
| Tetraciclina | Sigma Aldrich | 87128-25G | |
| (−)-Clorhidrato de tetramisol | Sigma Aldrich | L9756 | |
| Extracto de levadura | Fisher Scientific | BP1422-500 | |
| fuertes Tubos de | |||
| 15 mL | Fisher Scientific | 12-565-269 | |
| Pipetas serológicas desechables de poliestireno 10 mL | Fisher Scientific | 07-200-574 | |
| Pipetas serológicas desechables de poliestireno 25 mL | Fisher Scientific | 07-200-575 | |
| Placas de Petri bacteriológicas Falcon con tapa (35 mm x 10 mm) | Fisher Scientific | 08-757-100A | |
| No. 1.5 18 mm x 18 mm Cubierta Placas | Fisher Scientific | 12-541A | |
| con tapa transparente (60 mm x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| con tapa transparente (100 mm x 15 mm) | Portaobjetos | ||
| (75 mm x 25 mm) | Fisher Scientific | 12-544-4 | |
| Software | |||
| Prism | Graphpad | ||
| bacterias fuertes | |||
| S. oralis ATCC 35037 | |||
| S. mitis ATCC 49456 | |||
| S. gordonii DL1 Challis | |||
| E. coli OP50 | |||
| E. coli HT115 | |||
| Cepas de gusanos | |||
| Cepa | Genotipo | Transgén | Fuente |
| N2 | C. elegans aislado silvestre | CGC | |
| EU1 | skn-1(zu67) IV/nT1 [unc-?( n754) dejamos-?] (IV;V) | CGC | |
| LD002 | IdIs1 | SKN-1B/C::GFP + rol-6(su1006) | Keith Blackwell |
Referencias
- Human Microbiome Project, C. Structure, function and diversity of the healthy human microbiome. Nature. 486 (7402), 207-214 (2012).
- Mitchell, J. Streptococcus mitis: walking the line between commensalism and pathogenesis. Molecular Oral Microbiology. ....
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Reimpresiones y permisos
