14NH4+/15NH4+ Sıralı Dönüşüm Yoluyla N2O'ya Göre Amonyuma Nitrat Azaltma Nın Potansiyel Oranlarının Ölçülmesi
Summary
14NH4+/15NH4+ analizlerine dayalı potansiyel DNRA oranını belirlemek için bir dizi yöntem ayrıntılı olarak verilmiştir. NH4+ birkaç adımla N2O’ya dönüştürülür ve quadrupole gaz kromatografisi-kütle spektrometresi kullanılarak analiz edilir.
Abstract
Karasal ekosistemlerden sucul ekosistemlere aktarılan baskın N türü olan nitratın (NO3−)akıbetini anlamanın önemi, küresel azot yüklerinin sanayileşme sonrasında önemli ölçüde artması nedeniyle artmaktadır. Amonyuma (DNRA) ve denitrifikasyona kadar simizilar nitrat azaltma, solunum için NO3− kullanan mikrobik süreçlerdir. Denitrifikasyon ile karşılaştırıldığında, DNRA aktivitesinin kantitatif tayini sadece sınırlı ölçüde gerçekleştirilmiştir. Bu durum, DNRA’nın NO3− dönüşümlerde ve bu sürecin düzenleyici faktörlerinde öneminin yeterince anlaşılmasına yol açmıştır. Bu makalenin amacı, çevresel numunelerde potansiyel DNRA oranının ölçümü için ayrıntılı bir prosedür sağlamaktır. Kısaca, potansiyel DNRA oranı 15NO3– eklenen kuluçka 15N etiketli amonyum(15NH4+) birikim oranı hesaplanabilir. Bu yazıda açıklanan 14NH4+ ve 15NH4+ konsantrasyonlarının belirlenmesi aşağıdaki adımlardan oluşmaktadır. İlk olarak, Numunedeki NH4+ çıkarılır ve amonyum tuzu olarak asitlenmiş bir cam filtreüzerinde sıkışıp kalır. İkinci olarak, kapana kısılmış amonyum persülfat oksidasyonu yoluyla NO3−’e eluted ve oksitlenir. Üçüncü olarak, NO3− N 2 O2reductaze eksik denitrifier ile N2O dönüştürülür. Son olarak, dönüştürülmüş N2O daha önce geliştirilmiş bir quadrupole gaz kromatografisi-kütle spektrometresi sistemi kullanılarak analiz edilir. Bu yöntemi tuz bataklığı tortularına uyguladık ve önerilen prosedürlerin daha önce açıklanan yöntemlere göre daha basit ve daha hızlı bir belirleme sağladığını göstererek potansiyel DNRA oranlarını hesapladık.
Introduction
Azotlu gübrenin yapay sentezi ve yaygın uygulaması küresel azot döngüsünü büyük ölçüde tedirgin etti. Reaktif azotun karasal sistemlerden kıyı sistemlerine transferinin sanayi öncesi zamanlardan bu yana iki katına çıktığı tahmin edilmektedir1. Belirli bir alana uygulanan gübrelerin önemli bir kısmı topraktan nehirlere veya yeraltı sularına, öncelikle NO3− 2olarak yıkanır. Bu, içme suyu kirliliği, ötrofikasyon ve hipoksi oluşumu gibi çevresel sorunlara neden olabilir. NO3− su ortamlarında biyolojik asimilasyon ve çeşitli mikrobiyal sissimilatory süreçler ile ekosistemden çıkarılır veya korunur. Denitrifikasyon ve anammox NO3−için önemli mikrobiyal kaldırma işlemleri olduğu bilinmektedir. Denitrifikasyon NO3mikrobiyal azaltma – gaz N ürünleri (NO, N2O ve N2)organik maddeler gibi bir elektron donör oksidasyonu ile birleştiğinde, böylece yukarıda belirtilen sorunların riskini azaltarak. Anammox ayrıca NO2− ve NH4+n2 üretir; bu nedenle, bir ekosistemden inorganik N kaldırır. Tersine, DNRA bir ekosistemde N’yi korumak için çalışır; DNRA’nın öncelikle fermantif bakteriler veya chemolithootrofik bakteriler tarafından yapıldığı ve sentezsiz NO3− biyo-kullanılabilir ve daha az mobil NH4+azaltmak olduğu genel olarak kabul edilmektedir.
DNRA ile ilgili çalışmalar öncelikle okyanus veya haliç tortuları ve su, tuz veya acı bataklık toprağı ve mangrov toprağı gibi deniz veya haliç ekosistemlerinde yapılmıştır. Kıyı veya deniz ekosistemleri NO3– karasal ekosistemlerden kaldırmak için rezervuarlar olarak önemlidir, ve önceki çalışmalarda DNRA NO3çok geniş bir yelpazede katkıda bulunduğu gösterilmiştir− kaldırma (0-99%)3,4,5,6,,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18. Ayrıca, DNRA varlığı tatlı su ortamları19,pirinç çeltik toprakları20ve orman toprakları21dahil olmak üzere ortamlarda geniş bir yelpazede gösterilmiştir. Bu çalışmalar DNRA’nın NO3− kaldırma için denitrifikasyonla potansiyel olarak karşılaştırılabilir olduğunu gösterse de, DNRA aktivitesini ölçen çalışmalar denitrifikasyonu ölçenlerle karşılaştırıldığında hala çok sınırlıdır.
DNRA oranı analitik veya sayısal modeller aracılığıyla veri analizi ile birlikte 15N-etiketleme tekniği kullanılarak değerlendirilmiştir. DNRA oranını hesaplamak için bir analitik çözüm, 15NO3− bir izleyici olarak eklendikten sonra NH4+ havuzun 15N zenginleştirme deki artışa dayanır. 15.000 N etiketli NO3− bir numuneye eklenir ve kuluçkaya yatırılır ve DNRA oranı belirli bir süre den önce ve sonra NH4+ konsantrasyon ve izotop oranı değişikliklerinden hesaplanabilir. Bu yazıda, DNRA oranını hesaplamak için gerekli olan NH4+ konsantrasyonu ve izotop oranını ölçme yöntemi ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Temel olarak, burada bildirilen yöntem birkaç daha önce bildirilen tekniklerin 22,23,,24,25,26 bazı prosedürlere eklenen değişiklikler ile bir kombinasyonudur. Yöntem beş bileşenli prosedürlerin bir dizi oluşur: (1) kararlı bir izotop tracer, 15NO3−, (2) ekstraksiyon ve NH4kurtarma ile bir çevre numunesinin kuluçka+ modifikasyonları ile bir “difüzyon prosedürü” kullanarak, (3) NH4+ persülfat oksidasyonu + örnek, yerli NH4+ ve 15NH4+ 15NO3türetilen – No3− ve 15 NO 3− ve 15NO3sonrakimikrobiyal dönüşüm içine –ve 15NO3− modifiye denittrimetre yöntemi ile N2O izotopomerlere ve (5) gaz kromatografisi-kütle spektrometresi (GC/MS) kullanarak N2O izotopomerlerin niceleştirilmesine kadar. Aşağıdaki bölümde, ilk olarak, yordamlar (2) ve (4) için hazırlık açıklanır ve daha sonra, beş bileşen prosedürleri ayrıntılı olarak açıklanmıştır.
Protocol
Representative Results
Discussion
DNRA analizi için NH4+ konsantrasyon ve izotop oranı çeşitli yöntemler kullanılarak ölçüldü. NH4+ konsantrasyonları ve izotop oranları genellikle ayrı ayrı ölçülür. NH4+ konsantrasyonu genellikle bir autoanalyzer4,10,,15,,16,17dahil olmak üzere kolorimetrik yöntemler kullanı…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Naoto Tanaka’ya veri toplama ve protokolü geliştirmede yardımcı olduğu için teşekkür ederiz. Örneklerin toplanması JSPS KAKENHI Hibe Numarası 17K15286 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 15N-KNO3 | SHOKO SCIENCE | N15-0197 | |
| 15N-NH4Cl | SHOKO SCIENCE | N15-0034 | |
| 20 mL PP bottle | SANPLATEC | 61-3210-18 | Wide-mouth |
| Aluminum cap | Maruemu | 1307-13 | No. 20, with hole |
| Boric acid | Wako | 021-02195 | |
| Centrifuge | HITACHI | Himac CR21G II | |
| Deoxygenized Gas Pressure & Replace Injector | SANSIN INDUSTRIAL | IP-12 | |
| Disposable cellulose acetate membrane filter | ADVANTEC | 25CS020AS | Pore size 0.22 µm, 25 mm in diameter |
| Disposable syringe | Termo | SS-10SZ | 10 mL |
| Disposable syringe | Termo | SS-01T | 1 mL |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (-) | NISSUI PHARMACEUTICAL | 5913 | |
| Gastight syringe | VICI Valco Instruments | 4075-15010 | Series A-2, 100 µL |
| GC/MS | shimadzu | GCMS-QP2010ultra | |
| GF/D | Whatman | 1823-010 | 10 mm in diameter |
| Glass vial | Maruemu | 0501-06 | 20 mL |
| Gray butyl rubber stopper | Maruemu | 1306-03 | No.20-S |
| H2SO4 | Wako | 192-04696 | Guaranteed Reagent |
| K2S2O8 | Wako | 169-11891 | Nitrogen and Phosphorus analysis grade |
| KCl | Wako | 163-03545 | Guaranteed Reagent |
| KNO3 | Wako | 160-04035 | Guaranteed Reagent |
| NaOH | Wako | 191-08625 | Nitrogen compounds analysis grade |
| NH4Cl | Wako | 017-02995 | Guaranteed Reagent |
| Plastic centrifuge tube | ASONE | 1-3500-22 | 50 mL, VIO-50BN |
| Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens | American Type Culture Collection (ATCC) | ATCC 13985 | Freeze-dried, the type strain of Pseudomonas aureofaciens |
| PTFE sealing tape | Sigma-Aldrich | Z221880 | 25 mm in width |
| Reciprocating shaker | TAITEC | 0000207-000 | NR-10 |
| Screw-cap test tube | IWAKI | 84-0252 | 11 mL |
| PTFE-lined cap for test tube | IWAKI | 84-0262 | |
| Tryptic Soy Broth | Difco Laboratories | 211825 |
Referencias
- Gruber, N., Galloway, J. N. An Earth-system perspective of the global nitrogen cycle. Nature. 451 (7176), 293-296 (2008).
- Galloway, J. N., et al. The Nitrogen Cascade. Bioscience. 53 (4), 341-356 (2003).
- Rysgaard, S., Risgaard-Petersen, N., Sloth, N. P., Caumette, P., Castel, J., Herbert, R. Nitrification, denitrification, and nitrate ammonification in sediments of two coastal lagoons in Southern France. Coastal Lagoon Eutrophication and Anaerobic Processes (C.L.E.AN.). Developments in Hydrobiology. 117, 133-141 (1996).
- Christensen, P. B., Rysgaard, S., Sloth, N. P., Dalsgaard, T., Schwærter, S. Sediment mineralization, nutrient fluxes, denitrification and dissimilatory nitrate reduction to ammonium in an estuarine fjord with sea cage trout farms. Aquatic Microbial Ecology. 21, 73-84 (2000).
- Tobias, C. R., Anderson, I. C., Canuel, E. A., Macko, S. A. Nitrogen cycling through a fringing marsh-aquifer ecotone. Marine Ecology Progress Series. 210, 25-39 (2001).
- An, S. M., Gardner, W. S. Dissimilatory nitrate reduction to ammonium (DNRA) as a nitrogen link, versus denitrification as a sink in a shallow estuary (Laguna Madre/Baffin Bay, Texas). Marine Ecology Progress Series. 237, 41-50 (2002).
- Gardner, W. S., et al. Nitrogen fixation and dissimilatory nitrate reduction to ammonium (DNRA) support nitrogen dynamics in Texas estuaries. Limnology & Oceanography. 51 (1), 558-568 (2006).
- Preisler, A., et al. Biological and chemical sulfide oxidation in a Beggiatoa inhabited marine sediment. The ISME Journal. 1 (4), 341-353 (2007).
- Gardner, W. S., McCarthy, M. J. Nitrogen dynamics at the sediment-water interface in shallow, sub-tropical Florida Bay: why denitrification efficiency may decrease with increased eutrophication. Biogeochemistry. 95 (2-3), 185-198 (2009).
- Dong, L. F., et al. Changes in benthic denitrification, nitrate ammonification, and anammox process rates and nitrate and nitrite reductase gene abundances along an estuarine nutrient gradient (the Colne estuary, United Kingdom). Applied and Environmental Microbiology. 75 (10), 3171-3179 (2009).
- Koop-Jakobsen, K., Giblin, A. E. The effect of increased nitrate loading on nitrate reduction via denitrification and DNRA in salt marsh sediments. Limnology & Oceanography. 55 (2), 789-802 (2010).
- Dong, L. F., et al. Dissimilatory reduction of nitrate to ammonium, not denitrification or anammox, dominates benthic nitrate reduction in tropical estuaries. Limnology & Oceanography. 56 (1), 279-291 (2011).
- Fernandes, S. O., Bonin, P. C., Michotey, V. D., Garcia, N., LokaBharathi, P. A. Nitrogen-limited mangrove ecosystems conserve N through dissimilatory nitrate reduction to ammonium. Scientific Reports. 2, 419 (2012).
- Behrendt, A., de Beer, D., Stief, P. Vertical activity distribution of dissimilatory nitrate reduction in coastal marine sediments. Biogeosciences. 10 (11), 7509-7523 (2013).
- Song, G. D., Liu, S. M., Marchant, H., Kuypers, M. M. M., Lavik, G. Anammox denitrification and dissimilatory nitrate reduction to ammonium in the East China Sea sediment. Biogeosciences. 10 (11), 6851-6864 (2013).
- Yin, G., Hou, L., Liu, M., Liu, Z., Gardner, W. S. A novel membrane inlet mass spectrometer method to measure 15NH4+15+ for isotope-enrichment experiments in aquatic ecosystems. Environmental Science & Technology. 48 (16), 9555-9562 (2014).
- Zheng, Y., et al. Tidal pumping facilitates dissimilatory nitrate reduction in intertidal marshes. Scientific Reports. 6, 21338 (2016).
- Bu, C., et al. Dissimilatory Nitrate Reduction to Ammonium in the Yellow River Estuary: Rates, Abundance, and Community Diversity. Scientific Reports. 7, 6830 (2017).
- Scott, J. T., McCarthy, M. J., Gardner, W. S., Doyle, R. D. Denitrification, dissimilatory nitrate reduction to ammonium, and nitrogen fixation along a nitrate concentration gradient in a created freshwater wetland. Biogeochemistry. 87 (1), 99-111 (2008).
- Shan, J., et al. Dissimilatory Nitrate Reduction Processes in Typical Chinese Paddy Soils: Rates, Relative Contributions, and Influencing Factors. Environmental Science & Technology. 50 (18), 9972-9980 (2016).
- Silver, W. L., Herman, D. J., Firestone, M. K. Dissimilatory nitrate reduction to ammonium in upland tropical forest soils. Ecology. 82 (9), 2410-2416 (2001).
- Holmes, R. M., McClelland, J. W., Sigman, D. M., Fry, B., Peterson, B. J. Measuring 15N–NH4+ in marine, estuarine and fresh waters: An adaption of the ammonia diffusion method for samples with low ammonium concentrations. Marine Chemistry. 60 (3-4), 235-243 (1998).
- Sigman, D. M., et al. A bacterial method for the nitrogen isotopic analysis of nitrate in seawater and freshwater. Analytical Chemistry. 73 (17), 4145-4153 (2001).
- Weigand, M. A., Foriel, J., Barnett, B., Oleynik, S., Sigman, D. M. Updates to instrumentation and protocols for isotopic analysis of nitrate by the denitrifier method. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 30 (12), 1365-1383 (2016).
- Isobe, K., et al. Analytical techniques for quantifying 15N/14N of nitrate, nitrite, total dissolved nitrogen and ammonium in environmental samples using a gas chromatograph equipped with a quadrupole mass spectrometer. Microbes and Environments. 26 (1), 46-53 (2011).
- Miyajima, T., Tanaka, Y., Koile, Y. Determining 15N enrichment of dissolved organic nitrogen in environmental waters by gas chromatography/negative-ion chemical ionization mass spectrometry. Limnology and Oceanography. 3 (3), 164-173 (2005).
- Stevens, R. J., Laughlin, R. J., Burns, L. C., Arah, J. R. M., Hood, R. C. Measuring the contributions of nitrification and denitrification to the flux of nitrous oxide from soil. Soil Biology and Biochemistry. 29 (2), 139-151 (1997).
- Porubsky, W. P., Velasquez, L. E., Joye, S. B. Nutrient-replete benthic microalgae as a source of dissolved organic carbon to coastal waters. Estuaries and Coasts. 31 (5), 860-876 (2008).
- Huygens, D., et al. Mechanisms for retention of bioavailable nitrogen in volcanic rainforest soils. Nature Geoscience. 1 (8), 543-548 (2008).
- Rutting, T., Boeckx, P., Muller, C., Klemedtsson, L. Assessment of the importance of dissimilatory nitrate reduction to ammonium for the terrestrial nitrogen cycle. Biogeosciences. 8 (7), 1779-1791 (2011).
- Song, B., Lisa, J. A., Tobias, C. R. Linking DNRA community structure and activity in a shallow lagoonal estuarine system. Frontiers in Microbiology. 5, 460 (2014).
- Cheng, L., et al. Dissimilatory nitrate reduction processes in sediments of urban river networks: Spatiotemporal variations and environmental implications. Environmental Pollution. 219, 545-554 (2016).
- Lisa, J. A., Song, B., Tobias, C. R., Hines, D. E. Genetic and biogeochemical investigation of sedimentary nitrogen cycling communities responding to tidal and seasonal dynamics in Cape Fear River Estuary. Estuarine, Coastal and Shelf Science. 167, A313-A323 (2015).
- Deng, F. Y., et al. Dissimilatory nitrate reduction processes and associated contribution to nitrogen removal in sediments of the Yangtze Estuary. Journal of Geophysical Research: Biogeosciences. 120 (8), 1521-1531 (2015).
- Tiedje, J. M., Zehnder, A. J. B. . Biology of Anaerobic Microorganisms. , 179-244 (1988).
- Tiedje, J. M., Sexstone, A. J., Myrold, D. D., Robinson, J. A. Denitrification: ecological niches, competition and survival. Antonie van Leeuwenhoek. 48, 569-583 (1982).
- Hardison, A. K., Algar, C. K., Giblin, A. E., Rich, J. J. Influence of organic carbon and nitrate loading on partitioning between dissimilatory nitrate reduction to ammonium (DNRA) and N2 production. Geochimica et Cosmochimica Acta. , 164 (2015).
- Sigman, D. M., et al. Natural abundance-level measurement of the nitrogen isotopic composition of oceanic nitrate: an adaptation of the ammonia diffusion method. Marine Chemistry. 57 (3-4), 227-242 (1997).
- Risgaard-Petersen, N., Rysgaard, S., Revsbech, N. P. Combined microdiffusion-hypobromite oxidation method for determining nitrogen-15 isotope in ammonium. Soil Science Society of America Journal. 59 (4), (1995).
- Gardner, W. S., Bootsma, H. A., Evans, C., John, P. A. S. Improved chromatographic analysis of 15N:14N ratios in ammonium or nitrate for isotope addition experiments. Marine Chemistry. 48 (3-4), 271-282 (1995).
