Aquí describimos dos enfoques para caracterizar los eventos de polarización celular en linfocitos B durante la formación de un IS. El primero, implica la cuantificación del reclutamiento de orgánulos y reordenamientos del citoesqueleto en la membrana sináptica. El segundo es un enfoque bioquímico, para caracterizar los cambios en la composición del centrosoma, que se somete a polarización a la sinapsis inmune.
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Artículo de método
Estudio de la dinámica de los organelos en células B durante la formación de la sinapsis inmune
* These authors contributed equally
En este artículo
Resumen
Resumen
El reconocimiento de los antígenos de superficie por el receptor de células B (BCR) desencadena la formación de una sinapsis inmune (IS), donde se coordinan tanto la señalización como la admisión de antígenos. La formación de IS implica una remodelación dinámica de actina acompañada del reclutamiento polarizado a la membrana sináptica del centrosoma y los orgánulos intracelulares asociados, como los lisosomas y el aparato Golgi. Las etapas iniciales de la remodelación de actina permiten que las células B aumenten su superficie celular y maximicen la cantidad de complejos de antígeno-BCR reunidos en la sinapsis. Bajo ciertas condiciones, cuando las células B reconocen antígenos asociados a superficies rígidas, este proceso se acopla al reclutamiento local y la secreción de lisosomas, lo que puede facilitar la extracción de antígenos. Los antígenos recogidos se internalizan en compartimentos de endo-lisososoma sórdico especializados para su procesamiento en péptidos, que se cargan en moléculas principales del complejo de histocompatibilidad II (MHC-II) para su posterior presentación a las células auxiliares de T. Por lo tanto, el estudio de la dinámica de los órganos asociados con la formación de un IS es crucial para entender cómo se activan las células B. En el presente artículo discutiremos tanto la imagen como una técnica bioquímica utilizada para estudiar los cambios en el posicionamiento de los organosílamos intracelulares y los reordenamientos del citoesqueleto que están asociados con la formación de un IS en células B.
Introducción
Los linfocitos B son una parte esencial del sistema inmunitario adaptativo responsable de producir anticuerpos contra diferentes amenazas y patógenos invasores. La eficiencia de la producción de anticuerpos está determinada por la capacidad de las células B paraadquirir, procesar y presentar antígenos que se encuentran en una forma soluble o de superficie 1,2. El reconocimiento de antígenos unidos a la superficie de una célula presentadora, por elBCR, conduce a la formación de un contacto intercelular cercano llamado IS 3,4. Dentro de esta plataforma d....
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Protocolo
NOTA: Los siguientes pasos se realizaron utilizando células IIA1.6 B.
1. Activación de la célula B con perlas recubiertas de antígeno
- Preparación de perlas recubiertas de antígeno
- Para activar las células B, utilice NH2-perlas recubiertos covalentemente con antígeno (abalorios recubiertos de Ag), que se preparan con 50 sL (20 x 106 perlas) de 3 ám NH 2-perlas con antígenos activadores (BCR-ligand+) o no activadores (BCR-ligand-).
- Para las células IIA1.6 B utilice el fragmento anti-IgG-F(ab')2 como BCR-ligand+ y anti-IgM-F(ab')2 o albúmina sérica bovina (BSA) c....
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Resultados
El presente artículo muestra cómo las células B se pueden activar usando antígeno inmovilizado en perlas o cubrelips para inducir la formación de un IS. Proporcionamos información sobre cómo identificar y cuantificar la polarización de diferentes orgánulos por inmunofluorescencia y cómo caracterizar proteínas que sufren cambios dinámicos en su asociación al centrosoma, que se polariza al IS, utilizando un enfoque bioquímico.
La .......
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Discusión
Describimos un método integral para estudiar cómo los linfocitos B reorganizan su arquitectura intracelular para promover la formación de un IS. Este estudio incluye el uso de técnicas de imagen para cuantificar la distribución intracelular de orgánulos, como centrosoma, aparato Golgi y lisosomas durante la activación de la célula B, y cómo se polarizan al IS. Además, describimos un enfoque bioquímico para estudiar los cambios en la composición centrosomesoma sobre la activación de la célula B.
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
M.-I.Y. cuenta con el apoyo de una beca de investigación de la #1180900 FONDECYT. J.I., D.F. y J.L. contaron con el apoyo de becas de la Comisión Nacional de Ciencia y Tecnología. Agradecemos a David Osorio de la Pontificia Universidad Católica de Chile por la grabación y edición de vídeo.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| IIA1.6 (variante A20) células de linfoma B del ratón | ATCC | TIB-208 | Linfoma de células B murino de origen Balb/c que expresa un BCR que contiene IgG en su superficie sin FcγIIR |
| Metanol al 100% | Fisher Scientific | A412-4 | |
| Cristales circulares de vidrio de cobertura de 10 mm de diámetro, espesor No. 1 | Marienfield-Superior | 111500 | |
| 2-mercaptoetanol | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | |
| Alexa 488 fluor- asno anti-conejo IgG | LifeTech | A21206 | Se recomienda una dilución de 1:500, pero debe optimizarse |
| Alexa Fluor 546 cabra anti-conejo IgG | Thermo Fisher Scientific | A-11071 | Se recomienda una dilución de 1:500, pero debe optimizarse |
| Alexa Fluor 647-conjugado de ftaloidina | Thermo Fisher Scientific | A21238 | Se recomienda una dilución de 1:500, pero debe optimizarse |
| Kit Amaxa Nucleofección V | Lonza | VCA-1003 | Siga las instrucciones del fabricante para mezclar los reactivos de transfección con el ADN |
| Modelo Amaxa Nucleofector 2b | Lonza | AAB-1001 | Se utilizó el programa L-013 |
| Amino- Dynabeads | ThermoFisher | 14307D | |
| Anti-pericentrina | Abcam | ab4448 | Se recomienda una dilución de 1:200, pero debe optimizarse |
| Anti-rab6 | Abcam | ab95954 | Se recomienda una dilución de 1:200, pero debe optimizarse |
| Anti-sec61 | Abcam | ab15575 | Se recomienda una dilución de 1:200, pero debe optimizarse |
| BSA | Winkler | BM-0150 | |
| CaCl2 | Winkler | CA-0520 | |
| Plato de cultivo T25 | BD | 353014 | |
| Software Fiji | Fiji col. | ||
| Fluoromount G | Electron Microscopy Science | 17984-25 | |
| Glutamina | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| Glutaraldehído | Sigma | G7651 | |
| Glicina | Winkler | BM-0820 | |
| Anticuerpo anti-ratón IgG de cabra | Jackson ImmunoResearch | 315-005-003 | Ligando positivo IIA1.6 |
| Anticuerpo anti-IgM de ratón de cabra | Thermo Fisher Scientific | 31186 | Ligando negativo IIA1.6 |
| Suero fetal bovino HyClone | Thermo Fisher Scientific | SH30071.03 | Inactivar por calor a 56 oC durante 30 min |
| KCl | Winkler | PO-1260 | |
| Microscopio Leica SP8 TCS | Leica | ||
| NaCl | Winkler | SO-1455 | |
| Microscopio epifluorescente Nikon Eclipse Ti-E | Nikon | ||
| Parafilm | M | P1150-2 | |
| Paraformaldehído | Merck | 30525-89-4 | Diluir al 4% con PBS en un gabinete de seguridad, usar al momento |
| Penicilina-estreptomicina | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Líquido |
| Microesferas de amino polibead de 3,00μm | Polyscience | 17145-5 | |
| Poli-L-lisina | Sigma | P8920 | Diluir con agua estéril |
| Anticuerpo anti-alfa tubulina de conejo | Abcam | ab6160 | Se recomienda una dilución de 1:1000, pero debe optimizarse |
| Anticuerpo anti-lamp1 de conejo anti-ratón | Cell signaling | 3243 | Se recomienda una dilución de 1:200, pero debe optimizarse |
| Anti-cep55 de conejo | Abcam | ab170414 | Se recomienda una dilución de 1:500, pero debe optimizarse |
| Anticuerpo anti-Tubulina gamma de conejo | Abcam | ab16504 | 1:1000 para Western Blot |
| RPMI-1640 | Biological Industries | 01-104-1A | |
| Saponina | Merck | 558255 | |
| Pirveta de sodio | Thermo Fisher Scientific | 11360070 | |
| Sacarosa | Winkler | SA-1390 | |
| Tritón X-100 | Merck | 9036-19-5 | |
| Tubo 50 ml | Corning | 353043 |
Referencias
- Carrasco, Y. R., Batista, F. D. B. Cells Acquire Particulate Antigen in a Macrophage-Rich Area at the Boundary between the Follicle and the Subcapsular Sinus of the Lymph Node. Immunity. 27 (1), 160-171 (2007).
- Batista, F. D., Harwood, N. E.
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Reimpresiones y permisos
