En Vivo Estudio Funcional de Variantes Humanas Raras Asociadas a la Enfermedad Usando Drosophila

J.  Michael Harnish; Samantha  L. Deal; Hsiao-Tuan Chao; Michael  F. Wangler; Shinya Yamamoto

doi:10.3791/59658

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Artículo de método

En Vivo Estudio Funcional de Variantes Humanas Raras Asociadas a la Enfermedad Usando Drosophila

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DOI:

10.3791/59658

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20 de agosto de 2019

J. Michael Harnish^*¹ , Samantha L. Deal^*² , Hsiao-Tuan Chao¹^,³^,⁴^,⁵ , Michael F. Wangler¹^,²^,⁴ , Shinya Yamamoto¹^,²^,⁴^,⁵

¹Department of Molecular and Human Genetics, Baylor College of Medicine, ²Program in Developmental Biology, Baylor College of Medicine, ³Department of Pediatrics, Section of Neurology and Developmental Neuroscience, Baylor College of Medicine, ⁴Jan and Dan Duncan Neurological Research Institute, Texas Children's Hospital, ⁵Department of Neuroscience, Baylor College of Medicine

^* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

El objetivo de este protocolo es esbozar el diseño y la realización de experimentos in vivo en Drosophila melanogaster para evaluar las consecuencias funcionales de las variantes genéticas raras asociadas con las enfermedades humanas.

Resumen

Los avances en la tecnología de secuenciación han hecho que los conjuntos de datos de genoma completo y de exoma completo sean más accesibles tanto para el diagnóstico clínico como para la investigación en genética humana de vanguardia. Aunque se han desarrollado varios algoritmos in silico para predecir la patogenicidad de las variantes identificadas en estos conjuntos de datos, los estudios funcionales son críticos para determinar cómo las variantes genómicas específicas afectan la función proteica, especialmente por tener un sentido erróneo Variantes. En la Red de Enfermedades No Diagnosticadas (UDN) y otros consorcios de investigación de enfermedades raras, organismos modelo (MO) incluyendo Drosophila, C. elegans,pez cebra y ratones se utilizan activamente para evaluar la función de la enfermedad humana putativa Variantes. Este protocolo describe un método para la evaluación funcional de variantes humanas raras utilizadas en el Centro de Detección de Organismos Modelo Drosophila Core de la UDN. El flujo de trabajo comienza con la recopilación de información humana y MO de múltiples bases de datos públicas, utilizando el recurso web MARRVEL para evaluar si la variante es probable que contribuya a la condición de un paciente, así como diseñar experimentos eficaces basados en disponibles conocimientos y recursos. A continuación, se generan herramientas genéticas (por ejemplo, líneas de ADNc humanos T2A-GAL4 y UAS) para evaluar las funciones de las variantes de interés en Drosophila. Tras el desarrollo de estos reactivos, se pueden realizar ensayos funcionales de dos puntas basados en experimentos de rescate y sobreexpresión para evaluar la función de las variantes. En la rama de rescate, los genes de la mosca endógena se "humanizan" reemplazando el gen de la Drosophila ortopéloga por transgenes humanos de referencia o variante. En la rama de sobreexpresión, las proteínas humanas de referencia y variante se impulsan exógenamente en una variedad de tejidos. En ambos casos, cualquier fenotipo escorable (por ejemplo, letalidad, morfología ocular, electrofisiología) se puede utilizar como lectura, independientemente de la enfermedad de interés. Las diferencias observadas entre los alelos de referencia y de variante sugieren un efecto específico de la variante, y por lo tanto probablemente la patogenicidad. Este protocolo permite evaluaciones rápidas e in vivo de variantes putativas causantes de enfermedades humanas de genes con funciones conocidas y desconocidas.

Introducción

Los pacientes con enfermedades raras a menudo se someten a un arduo viaje conocido como la "odisea diagnóstica" para obtener un diagnóstico preciso¹. Se cree que la mayoría de las enfermedades raras tienen un fuerte origen genético, lo que hace que los análisis genéticos/genómicos sean elementos críticos del estudio clínico. Además de la secuenciación de paneles genéticos candidatos y el análisis de variación de los números de copia basados en microarrays cromosómicos, las tecnologías de secuenciación de todo el exónmio (WES) y de secuenciación del genoma completo (WGS) se han convertido en herramientas cada vez más valiosas en la última década....