Modelo robusto inducido por la ligatura de la periodontitis murina para la evaluación de los neutrófilos orales

Summary

Este artículo presenta un protocolo para establecer un modelo inducido por ligaduras de periodontitis murina que involucre múltiples molares maxilares, lo que resulta en áreas más grandes del tejido gingival y hueso involucrados para su posterior análisis, así como un menor uso de animales. También se describe una técnica para evaluar a los neutrófilos orales de una manera análoga a los sujetos humanos.

Abstract

Las principales ventajas de estudiar la fisiopatología de la enfermedad periodontal utilizando modelos murinos son el menor costo de los animales, la variedad de cepas modificadas genéticamente, el gran número de análisis que se pueden realizar en los tejidos blandos y duros cosechados. Sin embargo, muchos de estos sistemas están sujetos a críticas de procedimiento. Como alternativa, se puede emplear el modelo inducido por la ligatura de la enfermedad periodontal, impulsado por el desarrollo localizado y la retención de un microbioma oral disbiótico, que es rápidamente inducido y relativamente confiable. Desafortunadamente, las variantes del protocolo de periodontitis murina inducida por ligaduras están aisladas en regiones focales del periodontium y sujetas a la avulsión prematura de la ligadura instalada. Esto minimiza la cantidad de tejido disponible para análisis posteriores y aumenta el número de animales necesarios para el estudio. Este protocolo describe las manipulaciones precisas necesarias para colocar ligaduras molares extendidas con una mejor retención y el uso de una técnica de enjuague novedosa para recuperar neutrófilos orales en ratones con un enfoque alternativo que mitiga lo antes mencionado desafíos técnicos.

Introduction

La enfermedad periodontal (PD) es una afección osteolítica asociada a la morbilidad significativa del huésped y la carga económica, que se manifiesta por inflamación gingival y pérdida tanto de la unión de tejidos blandos como de soporte óseo para la dentición afectada^1,2,3,4. Este proceso se rige por interacciones entre la microbiota oral y el sistema inmunitario innato del huésped. También se asocia con la exacerbación de otras enfermedades inflamatorias sistémicas incluyendo diabetes, enfermedades cardiovasculares, y el cáncer

Protocol

Todos los estudios murinos cumplieron con las regulaciones éticas pertinentes y fueron aprobados por el Comité de Cuidado de Animales de la Universidad de Toronto y la Junta de ética de investigación (Protocolo 20011930).

1. Instalación de ligaduras

NOTA: Este es un procedimiento quirúrgico no estéril que se puede llevar a cabo en un quirófano estándar. El uso de animales libres de gérmenes (no cubiertos aquí) exige el manejo dentro de un gabinete de bioseguridad, el uso de instrumentos estériles, y la inoculación de la cavidad oral con patógenos periodontales para causar las manifestaciones clínicas de la periodon....

Results

Se proporcionan datos representativos de citometría de flujo a partir de muestras de enjuague oral de una ingenua(Figura 3A)e inflamadas(Figura 3B)cavidad oral murina secundaria a la periodontitis inducida por ligaduras. También se demuestra la recuperación de las PMN de una ligadura instalada(Figura 3C). Las tensiones de canal del citómetro de flujo se calibraron manualmente, y la .......

Discussion

El elemento más crítico asociado con el uso del modelo de periodontitis inducido por la ligadura murina se centra en la retención de la ligadura hasta el momento del sacrificio o la eliminación intencional. La ligadura biopelícula-retentiva instalada es capaz de inducir una pérdida significativa de la altura ósea alveolar en tan solo 6 días, estancando entre el período de 11-16 días³⁹. La decisión de sacrificar a los sujetos animales antes del período máximo de pérdida ósea, lo que lo convierte en.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-ratón F4/80 Anticuerpo	BioLegend	123131	BV421, Clon BM8
Anti-ratón Ly6G Anticuerpo	BD	560602	PerCP-Cy5.5, Clon 1A8
C57BL/6 Ratones machos	Charles River		8 a 12 semanas de edad
Tubo de centrífuga cónico	FroggaBio	TB15-500	15 mL
Tubo de centrífuga cónico	FroggaBio	TB50-500	50 mL
FACS Buffer	Múltiple 1		% BSA (BioShop), 2mM EDTA (Merck), 1x HBSS-/- (Gibco)
FACSDiva	BD		v8.0.1
Fibre-Lite	Dolan-Jenner		Modelo 180
FlowJo	Tree Star		v10.0.8r1
Bomba de terapia de calor	Hallowell		HTP-1500
Esterilizador de perlas de vidrio caliente	Ciencias de la Microscopía Electrónica	66118-10	Germinador 500
Tijeras de Iris	Almedic	7602-A8-684
Ketamina	Recta Vetoquinol		100mg/mL
LSRFortessa	BD		X-20
Suero de Ratón	Sigma	M5905-5ML
Filtro de Malla de Nylon	Fisher Scientific	22-363-547	40 & micro; m
Paraformaldehído	Fisher Scientific	28908	16% (p/v),
Solución salina samponada con fosfato	Sigma	D1408-500ML	sin CaCl2 y MgCl2, 10x
Jeringas Desechables de Plástico	BD 309659		1 mL
Rata	Sigma	R9759-5ML
Sutura	de sedaCovidien	SS652	C13 C13 USP 5-0
Pinza de astilla	Almedic	7726-A10-700	#1
Pinza de astilla	Almedic	7727-A10-704	#5
Microscopio de disección estereoscópica	Carl Zeiss	28865	Photo-Zusatz
Aguja hipodémica estéril	BD 305111		26G x 1/2
" Jeringa	BD	309659	1 mL
Xilacina	Rompun		20mg/mL