Geração de neuroesferas do hipocampal preliminar misturado e dos neurônios corticais isolados de E14-E16 embrião do rato de Sprague Dawley
Summary
Aqui apresentamos um protocolo para a geração espontânea de neuroesferas enriquecidas em células progenitoras neurais de neurônios chapeados de alta densidade. Durante a mesma experiência, quando os neurônios são chapeados em uma densidade mais baixa, o protocolo igualmente conduz às culturas preliminares prolongadas do neurônio de rato.
Abstract
A cultura primária do neurão é uma técnica essencial no campo da neurociência. Para obter insights mecanísticos mais profundos sobre o cérebro, é essencial ter um modelo in vitro robusto que pode ser explorado para vários estudos de neurobiologia. Embora as culturas preliminares do neurônio (isto é, culturas hippocampal a longo prazo) forneceram cientistas com modelos, não representa ainda a complexidade da rede do cérebro completamente. Na esteira dessas limitações, um novo modelo surgiu usando neuroesferas, que tem uma semelhança mais estreita com o tecido cerebral. O protocolo atual descreve o chapeamento de densidades elevadas e baixas de neurônios corticais e hippocampal misturados isolados do embrião do dia embrionário 14-16 ratos de Sprague Dawley. Isto permite a geração de neuroesferas e a cultura preliminar a longo prazo do neurônio como duas plataformas independentes para conduzir uns estudos mais adicionais. Este processo é extremamente simples e rentável, pois minimiza várias etapas e reagentes anteriormente considerados essenciais para a cultura do neurônio. Este é um protocolo robusto com requisitos mínimos que podem ser realizados com resultados alcançáveis e mais utilizados para uma diversidade de estudos relacionados à neurociência.
Introduction
O cérebro é um circuito intrincado de células neuronais e não-neuronais. Durante anos, os cientistas têm tentado obter informações sobre esta maquinaria complexa. Para isso, os neurocientistas recorreram inicialmente a várias linhagens celulares transformadas em nervo para investigações. No entanto, a incapacidade dessas linhagens de células clonais de formar conexões sinápticas fortes e axônios ou dendritos adequados mudaram o interesse científico para as culturas primárias do neurão1,2. O aspecto mais excitante da cultura do neurônio primário é que ele cria uma oportunidade para observar e manipular os neurônios vivos3. Além disso, é menos complexa em comparação com o tecido neural, o que o torna um candidato ideal para estudar a função e o transporte de várias proteínas neuronais. Recentemente, vários desenvolvimentos nas áreas de microscopia, genômica e proteômica têm gerado novas oportunidades para os neurocientistas explorarem as culturas neurais4.
As culturas primárias permitiram que os neurocientistas explorem os mecanismos moleculares por trás do desenvolvimento neural, analisem várias vias de sinalização neural e desenvolvam uma compreensão mais coerente da sinsicose. Embora uma série de métodos relataram culturas de neurônios primários (principalmente a partir da origem hipocampal5,6,7),um protocolo unificado com um meio quimicamente definido que permite a cultura de longo prazo de neurônios é ainda necessário. Entretanto, os neurônios chapeados em uma baixa densidade são observados o mais frequentemente, que não sobrevivem a longo prazo, provavelmente devido à falta do apoio trófico8 que é fornecido pelos neurônios adjacentes e pelas pilhas glial. Alguns métodos sugeriram até mesmo a coculturação dos neurônios primários com células gliais, onde as células gliais são usadas como uma camada de alimentador9. Entretanto, as pilhas glial levantam muitos problemas devido a seu overgrowth, que substituem às vezes o crescimento neuronal10. Assim, considerando os problemas acima, é necessário um protocolo de cultura neural primária mais simples e rentável, que pode ser usado tanto por neurobiólogos quanto por neuroquímicos para investigações.
Uma cultura primária de neurónios é essencialmente uma forma de cultura 2D e não representa a plasticidade, a integridade espacial ou a heterogeneidade do cérebro. Isso tem dado origem à necessidade de um modelo 3D mais crível chamado neuroesferas11,12. As neuroesferas apresentam uma nova plataforma para os neurocientistas, com uma semelhança mais estreita com o cérebro real, in vivo13. As neuroesferas são aglomerados 3D não aderentes de células que são ricas em células-tronco neurais (NSCs), células progenitoras neurais (NPCs), neurônios e astrócitos. Eles são uma excelente fonte para o isolamento de células-tronco neurais e células progenitoras neurais, que podem ser usadas para estudar a diferenciação em várias linhagens neuronais e não-neuronais. Outra vez, a variabilidade dentro das culturas da neurofera produzidas usando os protocolos previamente relatados apresenta uma barreira à formulação de um protocolo unificado da cultura da neurofera14.
Este manuscrito apresenta um protocolo em que é possível gerar ambas as plataformas 2D e 3D alternando densidades do chapeamento de pilha de uma cultura cortical e hippocampal misturada. Observa-se que dentro de 7 dias as neuroesferas livres-flutuantes são obtidas dos neurônios chapeados high-density isolados do embrião do rato de E14-E16 Sprague Dawley, que em cima da cultura mais adicional, formam pontes e interconexões através das extensões glial-como radiais. Similarmente, nos neurônios chapeados da baixa densidade, uma cultura preliminar do neurônio que possa ser mantida por até 30 dias é obtida mudando o meio da manutenção duas vezes por a semana.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo descreve que como alterando as densidades do chapeamento de pilha de neurônios preliminares, duas plataformas neuronal variáveis são obtidas. Embora este seja um método simples, cada etapa deve ser meticulosamente realizada para alcançar os resultados desejados. Outros métodos anteriores relataram culturas de neurônio primários de longo prazo ou culturas de neurofera. A maioria de protocolos preliminares da cultura do neurônio envolveram o cultivo de neurônios hippocampal por 3-5 semanas, mas a m…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a instalação animal da CSIR-IICB. G. D. graças ICMR, J. K. e V. G. agradecer DST Inspire, e D. M. obrigado DBT, Índia para suas bolsas. S. G. gentilmente reconhece SERB (EMR/2015/002230) Índia para fornecer apoio financeiro.
Materials
| Anti-GFAP | Abcam | AB7260 | |
| Anti- Nestin | Abcam | AB92391 | |
| Anti-O4 | Millipore | MAB345 | |
| Anti-Tau | Abcam | AB76128 | |
| Anti-Tuj1 | Millipore | MAB1637 | |
| B27 Serum Free Supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Cell Counter | Life technologies | Countess II FL | |
| CO2 Incubator | Eppendorf | Galaxy 170 R | |
| D-glucose | SDFCL | 38450-K05 | |
| Ethanol | Merck Millipore | 100983 | |
| Fluorescence Microscope | Olympus | IX83 Model | |
| Formaldehyde | Sigma Aldrich | 47608 | |
| GlutaMax-I Supplement | Gibco | 35050-061 | |
| GtXMs IgG Fluor | Millipore | AP1814 | |
| GtXMs IgG (H+L) | Millipore | AP124C | |
| HEPES | SRL | 16826 | |
| Hoechst 33258 | Calbiochem | 382061 | |
| Horse Serum | HiMedia | RM10674 | |
| Hydrochloric Acid | Rankem | H0100 | |
| Laminar Hood | BioBase | BBS-V1800 | |
| MEM Eagle’s with Earle’s BSS | Sigma Aldrich | M-2279 | |
| Microscope | Dewinter | Victory Model | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103-049 | |
| Plasticware (24 well plate, cell strainers, and low adherence plates) | BD Falcon | 353047, 352350 and 3471 | |
| 90 mm Petridishes | Himedia | PW001 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Poly-D-Lysine | Millipore | A.003.E | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Merck | MI6M562401 | |
| Sodium Chloride | Qualigem | 15918 | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Merck | MI6M562328 | |
| Stereomicrosope | Dewinter | Zoomstar Model | |
| Triton-X 100 | SRL | 2020130 | |
| Trypan Blue Solution | Gibco | 15250-061 | |
| 0.25 % Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-072 |
Referencias
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