Reconstitución asistida por detergente de Drosophila Atlastin recombinante en liposomas para ensayos de mezcla de lípidos

Resumen

La fusión de membranabiológica es catalizada por proteínas de fusión especializadas. La medición de las propiedades fusogénicas de las proteínas se puede lograr mediante ensayos de mezcla de lípidos. Presentamos un método para purificar la Drosophila atlastin recombinante, una proteína que media la fusión homotípica de la sala de urgencias, reconstituyéndola a liposomas preformados, y probando la capacidad de fusión.

Resumen

La fusión de membranas es un proceso crucial en la célula eucariota. Las proteínas especializadas son necesarias para catalizar la fusión. Las atlastinas son proteínas residentes de retículo endoplasmático (ER) implicadas en la fusión homotípica del ER. Aquí detallamos un método para purificar una glutatión S-transferasa (GST) y poli-histidina etiquetada Drosophila atlastin por dos rondas de cromatografía de afinidad. El estudio in vitro de las reacciones de fusión requiere que las proteínas de fusión purificadas se inserten en una bicapa lipídica. Los liposomas son membranas modelo ideales, ya que la composición y el tamaño de los lípidos pueden ajustarse. Con este fin, describimos un método de reconstitución mediante la eliminación de detergente para Drosophila atlastin en liposomas preformados. Si bien hay varios métodos de reconstitución disponibles, la reconstitución mediante eliminación de detergente tiene varias ventajas que lo hacen adecuado para atlastinas y otras proteínas similares. La ventaja de este método incluye un alto rendimiento de reconstitución y una orientación correcta de la proteína reconstituida. Este método se puede extender a otras proteínas de membrana y para otras aplicaciones que requieren proteoliposomas. Además, describimos un ensayo de mezcla de lípidos basado en FRET de proteoliposomas utilizados como medida de la fusión de membranas.

Introducción

La fusión de membranas es un proceso crítico en muchas reacciones biológicas. En condiciones biológicas, la fusión de membranas no es espontánea y requiere proteínas de fusión especializadas para catalizar tales reacciones¹. La fusión de membrana homotípica ER está mediada en animales por la gtamin relacionada con GTPase atlastin². El papel de Atlastin en la fusión homotípica es fundamental para las uniones de tres vías en ER periférico, que constituye una gran red interconectada de túbulos que se extienden a lo largo de la célula. Las atlastinas tienen una morfología de dominio conservada que consiste en una gran GTPase....

Protocolo

1. Purificación de GST-DAtl-His8

1. Expresión de proteínas y preparación de lisados
   1. Transforme BL21 (DE3) E. coli con la construcción GST-DAtl-His8 en pGEX4-T3² y seleccione en una placa de ampicilina.
   2. Seleccione un solo transformador e incubar 5 ml de LB + ampicilina (5 l de 100 mg/ml de ampicilina) en un tubo de cultivo de 14 ml e incubar a 25 oC con agitación a 200 rpm durante 6-8 h.
      NOTA: Debido a la expresión con fugas, no se recomienda incubar a temperaturas más altas. El crecimiento a 25oC reduce la agregación de proteínas durante este período de crecimiento.
   3. Inocul....

Resultados

La eficacia de la reconstitución de atlastin alastinas se presenta en la Figura2. Los proteoliposomas reconstituidos flotaron en un gradiente discontinuo de iohexol. La proteína no incorporada se sedimentó en la capa inferior (B) o en la capa media (M). La proteína reconstituida flotaría hasta la capa superior (T). Las muestras del gradiente fueron cosechadas y analizadas por tinción SDS-PAGE y Coomassie. La cuantificación del gel por densitometría muestra una eficiencia muy alta de reconsti.......

Discusión

Los métodos aquí delinean un método eficiente para purificar, reconstituir y medir la actividad de fusión de atlastina recombinante. Para garantizar altos rendimientos de atlastin funcional se deben considerar algunos pasos críticos. La expresión de atlastina debe realizarse a bajas temperaturas (16oC) para evitar la agregación y se debe apuntar a una concentración final entre 0,4-1,5 mg/ml. La proteína muy diluida no se reconstituirá de forma óptima en una proporción de proteína 1:400 a lípidos. La eficiencia de la reco.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Columnas de cromatografía de polietileno de 10 mL Biored		731-1550
10 mm x 75 mm Tubos de vidrio de sílex	VWR	608225-402
47 mm de diámetro, 0,45 μ m poro whatman filtros de membrana estéril	whatman	7141 104
96 pocillos placa blanca	NUNC	437796
Anapoe X-100	Anatrace	9002-931-1
Disruptor celular	Avestin	Avestin Emulsiflex C3
DOPS (1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfo-L-serina (sal de sodio)Avanti		840035P-10mg	DOPS
EDTA	Research organics inc.	6381-92-6 Cóctel de	ácido etilendiaminotetraacético
	Roche	11873580001	Extrusora completa de inhibidores de proteasa
	Sigma Aldrich	Z373400	Extrusora básica Liposofast
Sistema de cromatografía líquida GE Akta Prime	GE Pharmacia	8149-30-0006
Perlas de glutatión agarosa	Sigma aldrich	G4510-50ml
Glicerol	EMD	GX0185-5
GTP	Sigma Aldrich	36051-31-7	Guanosina 5' trifosfato sodio sal hidrato
HEPES, sin ácido	Omnipur	5330
Imidazol	fluka	5670
Columna de resina de cromatografía de afinidad de metales inmovilizada (IMAC)	GE Healthcare	17040801	1 mL HiTrap Quelante HP columnas de cromatografía de afinidad de metales inmovilizadas
Iohexol	Corporación química y científica precisa	AN 7050 BLK	Accudenz/Nycodenz
IPTG	Research products international corp.	I56000-100.0	IPTG,
L-Glutatión sin	Sigma-Aldrich	G4251-5g
Cloruro de magnesio	Fisher	7791-18-6
Metanol	Omnisolv	MX0488-1
NBD-DPPE (1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-il) (sal de amonio))	Avanti	236495	NBD-DPPE
n-Dodecil β-D-maltósido	Chem-Impex International	21950
Perlas adsorbentes de poliestireno no polar	BioRad	152-3920	SM2 Biobeads
Policarbonato de grabado de nucleporos 19 mm 0,1 μ membrana de poros	m Whatman	800309
Optima LE80K Ultra centrífuga	Beckman Coulter
Fosfatidilcolina, L-&alfa;-dipalmitoil [colina-metil-3H]	ARC	ART0284	Lípidos titulados lector de
placas	TECAN TECAN	infinite M200
de placas POPC (1-palmitoil-2-oleoil-glicero-3-fosfocolina)	Avanti	850457C-25mg	POPC
Cloruro de potasio	MP	151944
Rh-DPPE (1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-(lisamina rodamina B sulfonilo) (sal de amonio))	Avanti	236495	Rh-DPPE
Cóctel de centelleo	National Diagnostics	LS-272	Ecoscint XR Solución de centelleo para muestras acuosas o no acuosas
Centelleo	viales Beckman	592928	Tapón de giro rápido Mini Poly-Q Vial
Trombina	Sigma	T1063-1kU	Trombina de plasma humano
Triton X-100	Fisher	BP151-500
Tubos de centrífuga ultratransparentes 5 mm x 41 mm	Beckman	344090
Vórtice de 9 a 13 mm Soporte de tubo	VWR	58816-138	Inserto para tubos
de vidrio de sílex en vórticeRetenedor de inserto de vórtice	VWR	58816-132	Retenedor necesario para el soporte del tubo de vórtice
Vortexer	VWR	2.235074	Vortex Genie 2 modelo G560
β-mercaptoetanol grado de biología molecular	Calbiochem	444203

inhibidores de proteasa sin EDTA de dioxano reducido lector