Method Article

Inmunoglobulina G Análisis de N-Glycan por Cromatografía Líquida Ultra-Performance

DOI:

10.3791/60104

⸱

January 18th, 2020

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1Beijing Key Laboratory of Clinical Epidemiology, School of Public Health, Capital Medical University, 2School of Public Health, Shandong First Medical University & Shandong Academy of Medical Sciences, 3School of Medical and Health Sciences, Edith Cowan University

In This Article

Summary

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La inmunoglobulina G (IgG) N-glicano se caracteriza mediante cromatografía de interacción hidrófila UPLC. Además, la estructura de IgG N-glicano está claramente separada. Presentado aquí es una introducción a este método experimental para que pueda ser ampliamente utilizado en entornos de investigación.

Abstract

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Glycomics es una nueva subespecialidad en investigación de sistemas omics que ofrece un potencial significativo en el descubrimiento de biomarcadores de próxima generación para la susceptibilidad a enfermedades, el descubrimiento de objetivos de fármacos y la medicina de precisión. Se han notificado igG N-glicanos alternativos en varias enfermedades crónicas comunes y se ha sugerido que tienen un gran potencial en aplicaciones clínicas (es decir, biomarcadores para el diagnóstico y la predicción de enfermedades). Los IgG N-glicanos se caracterizan ampliamente utilizando el método de cromatografía de interacción hidrófila (HILIC) cromatografía líquida de ultrarendimiento (UPLC). UPLC es una tecnología de detección estable con buena reproducibilidad y alta precisión cuantitativa relativa. Además, la estructura de IgG N-glicano está claramente separada, y la composición de glicanos y la abundancia relativa en plasma se caracterizan.

Introduction

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N-glicosilación de proteínas humanas es una modificación post-traduccional común y esencial1 y puede ayudar a predecir la aparición y el desarrollo de enfermedades con relativa precisión. Debido a la complejidad de su estructura, se espera que haya más de 5.000 estructuras glicanas, proporcionando un gran potencial como biomarcadores diagnósticos y predictivos para enfermedades2. Se ha demostrado que los Nglicanos unidos a la inmunoglobulina G (IgG) son esenciales para la función de IgG, y IgG N-glicosilación participa en el equilibrio entre los sistemas pro yantiinflamatorio3....

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Protocol

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Todos los temas incluidos en el protocolo han sido aprobados por el Comité de ética de la Universidad Médica Capital, Beijing, China12. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de cada tema al comienzo del estudio.

1. Aislamiento IgG

  1. Preparar los productos químicos incluyendo tampón de unión (sina tamponada de fosfato, PBS): 1x PBS (pH a 7,4), tampón neutralizante: 10x PBS (pH a 6,6-6,8), eluyente: 0,1 M de ácido fórmico (pH a 2,5), solución neutralizante para eluyente: 1 M de bimonio de amonio, tampón de carbonato almacenado: 20% de ácido fórmico (pH a 2,5), solución neutralizante para eluyán: 1 M....

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Results

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Como se muestra en la Figura 1,los IgG N-glicanos se analizaron en 24 picos iniciales de IgG glicano (GPs) basados en la posición máxima y el tiempo de retención. Las estructuras N-glicano están disponibles a través de la detección de espectrometría de masas según un estudio anterior (Tabla 1)15. Para garantizar que los resultados fueran comparables, se aplicó la normalización total de la superficie,.......

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Discussion

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UPLC sirve como método de análisis cuantitativo relativo5,15. Los resultados indican que UPLC es una tecnología de detección estable con buena reproducibilidad y precisión cuantitativa relativa. La cantidad de glicanos en cada pico se expresa como un porcentaje del área integrada total utilizando UPLC, que es el valor relativo. La cuantificación relativa mejora la comparabilidad de las muestras de prueba. Además, 96 placas de proteína G de pozo se utilizan para p.......

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Disclosures

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Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgements

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Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la National Natural Science Foundation of China (81673247 y 81872682) y Australian-China Collaborative Grant (NH & MRC - APP1112767 -NSFC 81561128020).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2-aminobenzamida, 2-ABSigma, China
Placa colectora de 96 pocillosAXYGEN
Placa filtrante de 96 pocillosPol0,45 mmm GHP
Separaciones
Rotor de placa de 96 pocillosEppendorf Co., Ltd, AlemaniaT_1087461900
Ácido acéticoSigma, China
AcetonitriloHuihai Keyi Technology Co., Ltd, China
Bicarbonato de amonioShenggong Biological Engineering Co., Ltd, China
Formiato de amonioBeijing Minruida Technology Co., Ltd.
Incubadora / balancín de agitación constanteZhicheng fabricación de instrumentos analíticos Co., Ltd, ChinaZWY-10313
Escalera de calibración de dextrano / columna de glicopéptidosWatts technology Co., Ltd, ChinaColumna
BEH Dimetilsulfóxido (DMSO)Sigma, China
Fosfato disódicoShenggong Biological Engineering Co., Ltd, China
Hornos eléctricosTester instruments Co., Ltd202-2AB
Empower 3.0Waters technology Co., Ltd, América
EtanolHuihai Keyi Technology Co., Ltd, China
Ácido fórmicoSigma, China
GlycoProfile 2-AB Kit de etiquetadoSigma, China
HClJunrui Biotechnology Co., Ltd, China
Centrífuga de alta velocidadEppendorf Co., Ltd, Alemania5430
IgepalSigma, China
Centrífuga de baja temperaturaEppendorf Co., Ltd, Alemania
Refrigerador de baja temperaturaQingdao Haier Co., Ltd
Colector Placa de 96 pocillosTecnología de vatios Co., Ltd, China186001831
MetanolHuihai Keyi Technology Co., Ltd, China
Medidor de agua pura Milli-QMillipore Co., Ltd, AméricaVentaja A10
NaOHShenggong Biological Engineering Co., Ltd, China
Probador de PHSartorius Co., Ltd, AlemaniaPB-10
Solución salina tamponada con fosfato, PBSShenggong Biological Engineering Co., Ltd, China
PipetaEppendorf Co., Ltd, Alemania4672100, 0.5-10μ l & 10-100μ l & 20-200μ l & 1000μ l
PNGasa F enzimaSigma, China
Fosfato de dihidrógeno de potasioShenggong Biological Engineering Co., Ltd, China
Propan-2-olHuihai Keyi Technology Co., Ltd, China
SDSSigma, China
Cloruro de sodioShenggong Biological Engineering Co., Ltd, China
Cianoborohidruro de sodio (NaBH3CN)Sigma, China
EspectrofotómetroShanghai Yuanxi instrument Co., LtdB-500
Pistola de líquidode transferencia Smer Fell Science and Technology Co., Ltd, China4672100
TrisAmresco, América
Refrigerador de temperatura ultrabajaThermo Co., Ltd, AméricaMLT-1386-3-V; MDF-382E
Cromatografía líquida de ultra rendimientoWatts technology Co., Ltd, ChinaAcquity MLtraPerformance LC
Bomba de vacío Watts technology Co., Ltd, China725000604
Máquina volatilizadora/SecadoraEppendorf Co., Ltd, AlemaniaT_1087461900
VortexChangzhou Enpei instrument Co., Ltd, ChinaNP-30S
Baño de aguaTester instruments Co., LtdDK-98-IIA
Balanza de pesajeShanghai Jingke Scientific Instrument Co., Ltd.MP200B
Placa monolítica de 96 pocillos BIA

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kolarich, D., Lepenies, B., Seeberger, P. H. Glycomics, glycoproteomics and the immune system. Current Opinion in Chemical Biology. 16, 214(2012).
  2. Cummings, R., Pierce, J. M. The Challenge and Promise of Glycomics. Chemistry Biology. 21 (1), (2014).
  3. Shade, K. T.....

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IgG N Glycan AnalysisUltra Performance Liquid ChromatographyHydrophilic Interaction ChromatographyGlycan Composition AnalysisProtein G Monolithic PlateEndoglycosidase F EnzymeTwo Aminobenzimide LabelingUPLC Instrument CalibrationFluorescence Detection WavelengthsGlycan Peak Separation

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