Se desarrolló un protocolo de microdisección de captura láser (LCM) para obtener una cantidad suficiente de ARN de alta calidad para el análisis de la expresión génica en células óseas. El estudio actual se centra en las secciones del fémur del ratón. Sin embargo, el protocolo LCM reportado aquí se puede utilizar para estudiar la expresión génica en células de cualquier tejido duro.
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Artículo de método
Un protocolo de microdisección de captura láser que produce ARN de alta calidad a partir de huesos de ratón congelados
En este artículo
Resumen
Resumen
El rendimiento y la integridad del ARN son decisivos para el análisis del ARN. Sin embargo, a menudo es técnicamente difícil mantener la integridad del ARN a lo largo de todo el procedimiento de microdisección de captura láser (LCM). Dado que los estudios de LCM funcionan con cantidades bajas de material, también son importantes las preocupaciones sobre los rendimientos limitados del ARN. Por lo tanto, se desarrolló un protocolo LCM para obtener una cantidad suficiente de ARN de alta calidad para el análisis de la expresión génica en células óseas. Se evaluó el efecto del protocolo de tinción, el grosor de las criosecciones, la cantidad de tejido microdiseccionado, el kit de extracción de ARN y el sistema LCM utilizado en el rendimiento del ARN y la integridad obtenida de las células óseas microdiseccionadas. Las secciones óseas congeladas de ocho m de espesor se hicieron con una película adhesiva y se teñiron utilizando un protocolo rápido para una mancha comercial de LCM. La muestra se emparedó entre una membrana de tereftalato de polietileno (PET) y la película adhesiva. Un sistema LCM que utiliza la gravedad para la recolección de muestras y un método de extracción de ARN basado en columnas se utilizaron para obtener ARN de alta calidad de rendimiento suficiente. El estudio actual se centra en las secciones del fémur del ratón. Sin embargo, el protocolo LCM reportado aquí se puede utilizar para estudiar la expresión génica in situ en células de cualquier tejido duro tanto en condiciones fisiológicas como en procesos de la enfermedad.
Introducción
Los tejidos se componen de tipos de células heterogéneas y distribuidas espacialmente. Diferentes tipos de células en un tejido dado pueden responder de manera diferente a la misma señal. Por lo tanto, es esencial poder aislar poblaciones celulares específicas para la evaluación del papel de los diferentes tipos de células tanto en condiciones fisiológicas como patológicas. La microdisección de captura láser (LCM) ofrece un método relativamente rápido y preciso para aislar y extraer células especificadas de tejidos complejos1. Los sistemas LCM utilizan el poder de un rayo láser para separar las células de interés de las secciones del tejido his....
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Protocolo
El tejido óseo de ratones se utilizó en estricta conformidad con las directrices vigentes para el cuidado de los animales y se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento animal.
1. Animales e incrustaciones de congelación
- Animales de la casa en condiciones de temperatura ambiente constante (RT; 24 oC) y un ciclo oscuro de 12 h de luz/12 h con acceso gratuito a alimentos y agua.
NOTA: Los tejidos óseos de este estudio se obtuvieron de ratones machos de 3 meses de edad de tipo c57BL/6. - En la necropsia, los ratones exsanguiados de la vena cava abdominal bajo anestesia general (ketamina/xi....
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Resultados
Se desarrolló un protocolo LCM para obtener una cantidad suficiente de ARN de alta calidad para el análisis de la expresión génica en células óseas de fémures ratón. En el protocolo optimizado, se cortaron secciones óseas congeladas de 8 m de espesor en una película adhesiva y se teñieron utilizando un protocolo rápido para una mancha de sección congelada LCM comercial. La muestra se emparedó entre la membrana PET y la película adhesiva. Las células óseas del ratón se microdiseccionaron utilizando un sistema LCM que util.......
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Discusión
Tanto la calidad como la cantidad de ARN pueden verse afectadas negativamente en todas las etapas de la preparación de la muestra, como la manipulación de tejidos, el proceso de LCM y la extracción de ARN. Por lo tanto, se desarrolló un protocolo LCM para obtener una cantidad suficiente de ARN de alta calidad para el posterior análisis de la expresión génica.
Para LCM, la mayoría de los laboratorios utilizan secciones de 7 a 8 m de espesor2. Las secciones más gruesas permitirían la .......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores agradecen a Ute Zeitz y Nikole Ginner por su excelente ayuda técnica, así como al personal de Vetcore y de cuidado de animales por su apoyo.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 2-Mercaptoetanol | Sigma | 63689-25ML-F | |
| Etanol absoluto EMPLURA | Merck Millipore | 8,18,76,01,000 | |
| Película adhesiva (película LMD) | Section-Lab | C-FL001 | |
| Sistema de bioanalizador Agilent 2100 | Agilent Technologies | ||
| Agilent RNA 6000 Pico Chip Kit | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| Arcturus HistoGene Solución de tinción | Applied Biosystems | 12241-05 | |
| Herramienta de montaje de criopelícula | Section-Lab | C-FT000 | |
| Cryostat Leica CM 1950 | Leica Biosystems | ||
| Portaobjetos de microscopio de vidrio, color cortado naranja esmerilado | VWR Life Science | 631-1559 | |
| Histología Moldes de tejidos PVC | MEDITE | 48-6302-00 | |
| LMD7 Láser Mikrodissektion Sistema | Leica Microsystems | ||
| Cuchillas de micrótomo de perfil bajo Leica DB80 XL | Leica Biosystems | 14035843496 | |
| Agua sin nucleasas | VWR Life Science | E476-500ML | |
| Portaobjetos de membrana PET 1.4 μ m | Máquinas moleculares & Industries GmbH | 50102 | |
| Descontaminante de superficies RNase Away | BioProduct Molecular | 7002 | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | |
| Tissue-Tek compuesto de temperatura de corte óptima (OCT) | Sakura Finetek | 4583 | |
| Xileno | VWR Life Science | 2,89,73,363 |
Referencias
- Emmert-Buck, M. R., et al. Laser capture microdissection. Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).
- Legres, L. G., Janin, A., Masselon, C., Bertheau, P. Beyond laser microdissection technology: follow the yellow brick road for cancer research. American journal of Ca....
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Reimpresiones y permisos
