Dirigido al intestino delgado de la rata: infusión a largo plazo en la arteria mesentérica superior

Summary

El acceso para la infusión a largo plazo en la arteria mesentérica superior (AME) de ratas es un procedimiento quirúrgico que consiste en la canulación de una rama proximal de la AME. La cánula sale de la herida abdominal y se tuneliza a través del espacio subcutáneo de regreso al pliegue interescapular.

Abstract

La arteria mesentérica superior se puede canular en humanos a través de un cateterismo radiológico mínimamente invasivo de la arteria femoral o axilar. La canulación de AME es más difícil en ratas debido a las pequeñas dimensiones anatómicas. El objetivo del estudio es describir una técnica quirúrgica para la canulación de la AME en ratas para realizar la infusión a largo plazo de fármacos en el lecho vascular de la AME en animales sin restricciones, lo que dará como resultado una alta tasa de permeabilidad del catéter después de la recuperación postquirúrgica durante 24 horas.

Para evitar el riesgo de trombosis por AME o sangrado por acceso directo, se aísla una rama proximal de la AME, se liga distalmente y se canula con un tubo capilar de poliuretano de 0,25 mm cuya punta está avanzada cerca del origen de la AME de la aorta. La cánula se tuneliza por vía subcutánea hasta la parte posterior del cuello del animal y a través de la piel a través de una válvula artificial. La parte externa de la cánula se inserta en un sistema de soporte semirrígido y se conecta a la bomba de infusión continua fuera de la jaula donde la rata está libre para moverse.

El posicionamiento correcto de la cánula se demostró mediante la angiografía postquirúrgica y los hallazgos de la autopsia. La permeabilidad del catéter después de 24 horas de infusión salina en la región de AME se aseguró en la mayoría de las ratas mediante la descarga total de la bomba y el reconocimiento de una cánula funcional para la toma de muestras de sangre o la infusión de solución salina.

Introduction

La arteria mesentérica superior (AME) en humanos como en ratas se origina en la aorta abdominal y suministra al intestino sangre arterial desde el duodeno hasta el colon transverso proximal. SMA da lugar a numerosas ramas.

Después de la perfusión capilar, la circulación mesentérica se drena a través de la vena porta hasta el hígado, donde se somete al metabolismo hepático antes de ser readmitida en la circulación sistémica. La canulación de la AME es útil para fines de diagnóstico, embolización terapéutica e infusión de medicamentos de manera selectiva o continua para evaluar el efecto sobre el intestino o, lo que es más importante, el metabolismo hepático y el aclaramiento químico. En humanos, el cateterismo radiológico mínimamente invasivo de la AME se realiza para tratamiento ^{endovascular1} o infusión selectiva de ^fármacos2 utilizando varios abordajes percutáneos como la punción y canulación transfemoral o transaxilar.

Existen informes bibliográficos de diferentes técnicas de canulación de los pequeños vasos abdominales: la vena mesentérica superior (SMV)³, la arteria mesentérica inferior (IMA)⁴, el conducto linfático mesentérico5, la arteria ^hepática6 o estudios ex vivo sobre perfusión ^intestinal7 en ratas. En comparación con el lado venoso, la canulación de la AME en ratas es mucho más exigente debido a los riesgos simultáneos de trombosis y sangrado, siempre que su alta presión. En particular, surgen problemas en caso de que la canulación esté en funcionamiento cuando la rata se despierta de la anestesia en la cama quirúrgica y más si el experimento requiere un animal libre en una jaula después de la cirugía.

Un artículo reciente ha descrito la canulación de AME como parte del experimento (medida de la presión arterial) en un animal bajo ^anestesia8. Sin embargo, no se describe ninguna técnica sobre la canulación quirúrgica de la AME para la infusión a largo plazo en un animal sin restricciones. El objetivo de este manuscrito es describir paso a paso una técnica quirúrgica para la canulación a largo plazo de la AME a través de una rama proximal, que permite la infusión selectiva de fármacos en el lecho mesentérico durante al menos 24 horas (y más). Como una canulación constante y robusta requiere la ligadura permanente y el cierre del vaso donde se inserta el catéter, esta técnica evita insertar el catéter directamente en el ^SMA9 y se acerca al vaso a través de la canulación de una rama proximal, lo más proximal posible hasta el origen mismo de la AME de la aorta. La infusión proximal permite que el fármaco infundido alcance el lecho anatómico más ancho posible, sin cerrar el flujo sanguíneo a través del vaso principal.

La técnica de canulación SMA de rata tiene muchas aplicaciones. Sería posible administrar fármacos de forma selectiva en el compartimento arterial mesentérico para obtener acción local a nivel gastrointestinal y evitar efectos sistémicos y metabolismo hepático del fármaco. El modelo de rata canulada con SMA tiene ventajas sobre los modelos animales más grandes: es menos costoso, es éticamente aceptable y es más fácil de realizar y aprender. La cirugía de canulación de AME también es más fácil de realizar en el modelo de rata en comparación con el modelo de ratón.

Protocol

Los estudios descritos en este manuscrito fueron aprobados por el Comité de Ética Animal local (Università Cattolica del Sacro Cuore, Roma) y se realizaron de acuerdo con el Ministerio de Salud italiano.

1. Preparación de la cánula para su inserción en la rama proximal de la AME

1. Corte la cánula más grande de 0,93 mm O.D, 0,5 mm I.D. a la longitud requerida (aproximadamente 30 cm).
2. Corte la cánula más pequeña (0,4 mm O.D, 0,25 mm I.D.) a unos 5 cm de longitud e insértela 1 cm en la cánula más grande.
3. Fije las dos cánulas juntas mediante pegamento de cianoacrilato, evitando la oclusión del lumen.
4. Conecte la extremidad libre de la cánula más grande a un adaptador luer (23 G) montado en una jeringa de 1 ml llena de solución salina.
5. Afila la punta libre de la cánula más pequeña con tijeras para facilitar la inserción del catéter en la rama de la AME.
6. Compruebe la permeabilidad de la cánula enjuagando con solución salina.
   NOTA: El extremo afilado de la cánula no dañará la arteria durante el movimiento del animal porque se fijará y no se deslizará a lo largo del vaso.

2. Preparación de la rata para el procedimiento quirúrgico

1. Realizar anestesia intramuscular con ketamina/xilazina (100/10 mg/kg).
   NOTA: La profundidad anestésica suficiente se juzga por la ausencia o casi ausencia del reflejo de pellizco de la pata.
2. Afeitar el pelaje de las regiones quirúrgicas: el abdomen para la rama de la canulación de AME y la parte posterior del cuello para la salida de la cánula.
3. Limpie las regiones quirúrgicas asépticamente usando un reflejo quirúrgico de pellizco de la pata.
   NOTA: Toda la preparación debe realizarse con técnica aséptica.
4. exfoliante o solución aplicada en un movimiento circular, seguido de solución salina estéril o etanol al 70%, 3 veces.
5. Coloque al animal en posición supina, inmovilizando las cuatro extremidades.

3. Canulación de una rama proximal de la AME

1. Asegure la profundidad anestésica adecuada probando el reflejo de pellizco de la pata antes de la incisión.
2. Aplique una cortina quirúrgica estéril resistente al agua.
3. Con una cuchilla de bisturí, abra la pared abdominal con una incisión recta de 3 cm en la línea media de la región mesogástrica a través de todos los planos abdominales hasta el peritoneo.
4. Coloque las gasas, empapadas con solución salina, alrededor de la incisión de laparotomía en la parte superior de la cortina quirúrgica. Use suturas para mantener abierta la incisión quirúrgica.
   NOTA: Todos los hisopos e instrumentos quirúrgicos deben ser estériles.
5. Use hisopos de algodón para identificar y exponer el intestino delgado. Siga su disposición natural para identificar el mesenterio. Extraiga el mesenterio del corte laparotómico y colóquelo hacia abajo sobre las gasas (Figura 1A).
6. Identifique la AME sintiendo la pulsación.
7. Use los hisopos de algodón para "abrir paso" entre la grasa mesentérica y descubrir la AME y 2-3 de sus ramas proximales.
8. Elija una rama proximal de la AME lo suficientemente grande como para permitir las maniobras quirúrgicas de canulación. Ata esta rama (con una sutura de seda 4-0) 3-4 cm aguas abajo de su origen para permitir su expansión manteniendo los extremos de sutura el tiempo suficiente para ser manipulados más tarde.
9. Coloque un soporte rígido debajo de la rama de la SMA. El mango de las pinzas quirúrgicas es suficiente aquí.
10. Sostenga la extremidad de la cánula más pequeña (unida con la cánula más grande en la extremidad opuesta) con la mano dominante usando fórceps y tire de los extremos de la sutura con la otra mano para tensar el vaso y facilitar la entrada del catéter (Figura 1B).
11. Sostenga la punta de la cánula en un ángulo de 20 ° desde el plano del vaso en la dirección opuesta al flujo sanguíneo.
12. Presione ligeramente la punta para penetrar la pared de la arteria e inserte la cánula.
    NOTA: La canulación se realiza sin cortar la arteria; la punta del catéter romperá la pared del vaso y facilitará la entrada. La sangre que fluye de regreso a la cánula confirma la inserción correcta.
13. Continuar la inserción de la cánula durante otros 1 cm en la rama arterial cercana al origen de la AME.
14. Fijar la cánula a la arteria con un nudo quirúrgico (seda 4-0) y verificar su correcto funcionamiento enjuagando 1 ml de solución salina estéril o con una muestra de sangre.

4. Tunelización de la cánula y colocación en el sistema de soporte de infusión

1. Coloque una cortina quirúrgica estéril en la incisión antes de cambiar la posición del animal.
   NOTA: El túnel desde la espalda hasta el abdomen se crea ejerciendo presión en el espacio subcutáneo con un instrumento quirúrgico puntiagudo. Se debe usar una cortina quirúrgica estéril en el abdomen y las incisiones de la espalda.
2. Haga una incisión de 1 cm en la región posterior del cuello y acomode una válvula esférica.
3. Pasar la cánula desde la laparotomía de acceso a la válvula colocada en el cuello a través de los tejidos subcutáneos (Figura 2A). Cierre la extremidad distal de la cánula con un tapón de catéter para evitar la entrada de aire.
4. Reemplace el intestino delgado en la cavidad abdominal. Cierre la pared abdominal y cierre las incisiones de la piel con una sutura de seda continua 3-0.
5. Asegure la válvula a la piel del cuello con puntos de sutura. Cierre las incisiones de la piel con una sutura de seda continua 3-0.

5. Gestión postoperatoria

1. Viste a la rata con una chaqueta para proteger la válvula del botón. Proteja la parte expuesta de la cánula con una varilla de acero durante la infusión y asegúrela a la válvula (Figura 2B).
   NOTA: Dado que la cirugía se realiza bajo técnica aséptica, los antibióticos no están indicados. Los AINE deben administrarse antes de la operación para el control del dolor (5 mg/ml de Meloxicam inyectable, 1 mg/kg una vez al día durante un máximo de 3 días). Después de la operación, estabilice la rata en una jaula metabólica durante el tiempo de infusión (24h). Luego vuelva a anestesiar a la rata con inhalación de isoflurano durante el tiempo necesario para desmontar el sistema de infusión. Posteriormente, es posible alojar a la rata en una jaula normal con un ciclo de luz / oscuridad de 12 horas y acceso gratuito a alimentos y agua.
2. Estabilizar la rata en una jaula metabólica durante el tiempo de infusión. La rata ahora está despierta y libre para moverse y comer en la jaula.
3. Conecte la extremidad distal de la cánula a una bomba elastomérica (volumen máximo de 100 ml, caudal de 5,0 ml/h) llena de 50 ml de solución salina estéril. Proceder con la infusión durante 24 horas (Figura 2C).
4. El primer día, administrar antibióticos intramusculares (enrofloxacina 10 mg/kg durante las primeras 24 h) y luego pasar a la administración oral (enrofloxacina 100 mg en 500 ml en agua potable). Dispensar terapia analgésica por vía intramuscular durante el despertar (ketoprofeno 5,0 mg/kg) y en los días siguientes por vía oral (paracetamol 200 mg en agua potable).
   NOTA: Diluir la terapia oral administrada en agua potable para obtener un sabor soportable. Controle la medición del peso corporal y la hidratación.
5. Al final del tiempo de infusión (24 horas), desmonte el sistema de infusión externo del animal retirando la bomba, la camisa, la varilla de acero y la válvula de la rata. Cierre y corte la cánula a medida que sale del cuello, dejando esta extremidad debajo de la piel del cuello después de la sutura de la herida.
   NOTA: En esta fase puede ser necesario anestesiar a las ratas durante unos minutos por inhalación de isofluorano.
6. Aloja a la rata, individualmente, en una jaula normal con un ciclo de luz / oscuridad de 12 horas y acceso gratuito a alimentos y agua.
   NOTA: La ingesta basal de alimentos después de la operación es de aproximadamente 30 g. / día La ingesta de agua de referencia es de aproximadamente 50 ml / día. El peso promedio debe ser de aproximadamente 400 mg.

Results

En este estudio, el procedimiento se realizó en 15 ratas. Al final de las 24 horas de infusión salina, no se han observado signos de pérdida salina o de sangre en las jaulas metabólicas y la herida abdominal estaba limpia en todos los animales, al igual que en las jaulas.

En las jaulas normales, se observaron ratas durante 5 días con monitoreo diario del peso y la ingesta de agua / alimentos. Durante este período, el estado general de los animales en el examen macroscópico fue bueno sin indicios de anomalías de comportamiento. Todas las ratas inmediatamente después de la cirugía comenzaron a alimentarse nuevamente. La ingesta diaria promedio de alimentos y agua aumentó progresivamente hasta lo normal después de 3 días, como se muestra en la Figura 3A y 3B, respectivamente. En la Figura 3C, es posible ver que el aumento de peso fue regular, aumentando gradualmente hasta el final del período de observación. No se produjeron alteraciones de los movimientos intestinales y la producción diaria de heces y orina fue normal.

Después de 24 horas, había residuos salinos (respectivamente, 40 ml y 20 ml) en solo 2 bombas llenas con 50 ml de solución salina, mientras que todas las demás (86,7%) estaban vacías. Además, después de este período de infusión, 12 cánulas (80%) seguían siendo funcionales tanto para la toma de muestras de sangre como para la infusión salina (5 ml), mientras que 3 cánulas ya no eran patentes (2 de ellas eran las cánulas conectadas a las bombas con residuos) (Tabla 1).

En la necropsia, el 100% de las cánulas (n = 15) todavía estaban localizadas en la rama de AME y ninguna rata tenía signos de isquemia intestinal (Figura 4B) o sangrado intrabdominal. Las 3 cánulas ocluidas se encontraron torcidas respectivamente a 0,5 cm, 1 cm y 1,5 cm de la inserción en la rama SMA. Este fenómeno se debe probablemente a los movimientos de los animales en las jaulas.

En 5 ratas, inmediatamente después del procedimiento y antes de la conexión de la bomba, se inyectaron 2 ml de medio de contraste yodado en la cánula mesentérica, para obtener una angiografía a través de un intensificador de imagen (la angiografía se realizó intraoperatoriamente). En cada rata (n=5), fue posible ver el círculo arterial mesentérico y la AME y sus ramas principales sin medio de contraste que se extendiera en el abdomen como se muestra en la Figura 4A. Esto confirmó que la cánula estaba bien colocada y fijada a la rama de la SMA.

Figura 1: Fotografías experimentales. (A) El intestino delgado siguiendo su disposición natural en una gasa (es posible visualizar la AME con todas las ramas); (B) El operador que inserta la cánula en la rama SMA. Es necesario tener un soporte sólido debajo del recipiente para garantizar la inserción del tubo. La sutura de seda distal cierra el vaso y la proximal fija el catéter dentro de la rama. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Sistema de soporte de infusión. (A) Una vez tunelizada por vía subcutánea, la cánula emerge de la región posterior del cuello a través de la válvula blanca; (B) Una rata que lleva una chaqueta para estabilizar la válvula blanca. Una varilla de acero protege el catéter durante la infusión. (C) Representación diagramática de una rata alojada en una jaula metabólica durante la infusión de solución salina con una bomba elastomérica conectada a la cánula que sale de la varilla de acero. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Datos representativos para la ingesta de alimentos, la ingesta de agua y el aumento de peso de ratas (n = 15) en período de observación de 5 días. La ingesta diaria promedio de alimentos (A) y agua (B) aumenta progresivamente, y se estabiliza en niveles fisiológicos después de 3 días. El aumento de peso promedio (C) aumenta gradualmente hasta el final del período de observación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Fotografías de (A) la angiografía de contraste de la región arterial mesentérica después de la infusión de contraste a través de la cánula (prueba de cánula colocada adecuadamente) y (B) la cánula aún bien posicionada durante la autopsia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

	Bomba elastomérica		Cánula
	Vacío	Con residuos	Patente	No patente
n=15	13	2	12	3
%	86.7	13.3	80	20

Tabla 1: Descarga de la bomba elastomérica y permeabilidad de la cánula después de 24 horas de infusión salina. La permeabilidad se probó extrayendo sangre con una jeringa e infundiendo 5 ml de solución salina en la cánula.

Discussion

La principal ventaja de este modelo de infusión de AME de rata es su firmeza y durabilidad durante al menos 24 horas en la gran mayoría de los animales. La infusión de anticoagulante podría alargar este intervalo de tiempo. El modelo permite una infusión confiable de medicamentos selectivamente en la región mesentérica, dirigida al intestino delgado y la parte proximal del colon.

Varios pasos son críticos para el éxito de la técnica. Para lograr la canulación en un recipiente muy pequeño, es importante seleccionar ratas que pesen al menos 400 g; el sexo y la edad no son relevantes. También es importante elegir los instrumentos quirúrgicos correctos y el tipo de cánula. Aquí, se inserta una cánula de poliuretano más pequeña (0,4 mm O.D, 0,25 mm I.D.) 1 cm en la cánula más grande (0,93 mm O.D, 0,5 mm I.D.) para obtener un catéter funcional y útil que permita ambas conexiones a la arteria pequeña y al sistema de infusión más grande.

El primer paso crítico quirúrgico es limpiar la AME y la rama identificada para la canulación del tejido adiposo circundante (paso 3.5). Esto ayuda a evitar la inserción de la cánula entre el tejido y la arteria, que es un error común. Sin embargo, este paso de limpieza es difícil ya que la pequeña rama de la AME es frágil y fácil de dañar. Si la rama está lesionada, es posible detener el sangrado por ligadura y elegir una rama proximal diferente, para no desperdiciar al animal.

Para evitar la formación de burbujas de aire dentro de la cánula y evitar la embolia gaseosa, la cánula debe llenarse con solución salina hasta la punta antes de la inserción en la rama. Para asegurar la cánula en su lugar, la aplicación de hilo quirúrgico (seda 4-0) debe estar entre el punto de inserción en la arteria y la punta de la cánula, directamente en la parte superior del vaso alrededor del catéter. El nudo quirúrgico debe estar lo suficientemente apretado como para fijar la cánula, pero no demasiado apretado para ocluirla (paso 3.12).

La mejor manera de asegurar una canulación correcta es ver el flujo sanguíneo a través de la cánula (paso 3.10). En términos de solución de problemas, si esto no tiene lugar, puede deberse a las siguientes razones:

la cánula no se insertó correctamente en la arteria;

la cánula está dentro de la arteria pero ocluida por el nódulo en una posición incorrecta;

la cánula está dentro de la arteria y una burbuja de aire en la cánula está ralentizando el flujo;

se ha formado un coágulo dentro de la cánula.

Una inserción incorrecta puede deberse a la posición de la cánula en el espacio entre la arteria y el tejido adiposo. En este caso, es necesaria la reinserción. Cuando el nudo sobre el recipiente ocluye la cánula, es posible desatarla con mucho cuidado y rehacerla. Las pequeñas burbujas de aire en el catéter generalmente no comprometen la canulación y no ponen en peligro la vida; pero si hay una gran burbuja de aire en la cánula, es necesario volver a tirar de la cánula con la jeringa o volver a colocar el catéter en una rama diferente. Por lo general, es posible evitar la formación de coágulos y mantener la cánula patente mediante la infusión de bolos de solución salina de 0,2 ml de vez en cuando durante la operación.

Una limitación de este estudio es una subevaluación de la permeabilidad de la cánula en tiempos de infusión más largos: aquí, se realizó una infusión de 24 horas mientras las ratas estaban alojadas en una jaula metabólica. Para obtener un período de infusión más largo, puede ser útil utilizar la terapia anticoagulante, no administrada en este estudio. Sin embargo, durante la infusión, la rata debe ser alojada en la jaula metabólica porque es la única que soporta el sistema de infusión. Esta ubicación es incómoda para el animal, que podría estar estresado si se trata durante un período más largo. Además, solo se utilizó solución salina para perfusión, por lo que no hay resultados sobre la administración específica del fármaco. Una limitación del método es la imposibilidad de infundir en las ramas arteriales (si están presentes) por encima de la utilizada para el catéter. Por esta razón se recomienda cannular la rama más cercana de la aorta.

Ningún otro modelo de infusión a largo plazo de AME de rata para animales sin restricciones está presente en la literatura. En comparación con el modelo de canulación IMA descrito hace muchos ^años4, la técnica aquí descrita tiene un objetivo experimental más amplio porque permite la infusión de fármacos en el área de perfusión de AME y no se limita al colon. Recientemente, por primera vez, se utilizó la canulación selectiva de una rama de la AME para la infusión de toxina botulínica directamente en la región mesentérica arterial para estudiar el efecto sobre el músculo liso ^intestinal10, pero muchos otros fármacos podrían probarse en el futuro. Por ejemplo, se pueden infundir anticoagulantes para estudiar la trombosis mesentérica, o fármacos con una acción de microbiota ^intestinal11 o incluso fármacos para enfermedades inflamatorias ^{intestinales12}. La infusión intraarterial es útil para estudios de metabolismo intestinal en particular, porque el efecto del fármaco es evaluable antes de que la sangre pase por la circulación portal donde está sujeta al metabolismo hepático.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Portaagujas de madera crilé	2Instrumentos		Forma de la punta: recta; Ancho de la punta: 2 mm; Longitud de sujeción: 14 mm; Cerradura: Sí; Tijeras: No; Aleación / Material: acero inoxidable; Longitud: 15 cm; Dentado: Sí
Pinza Graefe Extra Fina	2Instrumentos Biológicos		Ancho de la punta: 0,5 mm; Dimensiones de la punta: 0,5 x 0,5 mm; Aleación / Material: acero inoxidable; Longitud: 10 cm
Luer Stub Adapter	BD Intramedic		calibre 23 para usar con tubo 427410
Válvula de membrana	Biomed	Mod 617
Catéter de poliuretano	ENKI		diámetro externo: 0,4 mm, diámetro interno: 0,25 mm
Catéter Silastic Tubo de laboratorio	Industrias de la salud	508-002
Tijeras de resorte	2Instrumentos		Forma de la punta: Angulada; Puntas: Agudas; Aleación / Material: Acero inoxidable
Tijeras quirúrgicas para estudiantes 2Instrumentos		biológicos	Forma de la punta: recta; Aleación / Material: Acero inoxidable del estudiante; Dentado: No; Característica: Calidad del estudiante