Interrogatorio paralelo del reclutamiento de la serie 2 para la detección de ligandos a escala de GPCR a escala mediante el ensayo PRESTO-Tango

Resumen

Dado que los GPCR son objetivos atractivos para drogarse, el cribado de ligando GPCR es por lo tanto indispensable para la identificación de compuestos de plomo y para estudios de desorfanización. Hacia estos esfuerzos, describimos PRESTO-Tango, una plataforma de recursos de código abierto utilizada para la elaboración simultánea de perfiles de reclutamiento transitorio de é-arrestin2 en aproximadamente 300 GPCRs utilizando un ensayo de reportero basado en TEV.

Resumen

Como la superfamilia genética más grande y versátil y los mediadores de una gama de vías de señalización celular, los receptores acoplados a proteínas G (GPCR) representan uno de los objetivos más prometedores para la industria farmacéutica. Ergo, el diseño, la implementación y la optimización de los ensayos de detección de ligandos GPCR es crucial, ya que representan herramientas de control remoto para el descubrimiento de fármacos y para manipular la farmacología y los resultados de GPCR. En el pasado, los ensayos dependientes de la proteína G tipificaran esta área de investigación, detectando eventos inducidos por ligandos y cuantificando la generación de mensajeros secundarios. Sin embargo, desde el advenimiento de la selectividad funcional, así como una mayor conciencia de varias otras vías independientes de la proteína G y las limitaciones asociadas con los ensayos dependientes de la proteína G, hay un mayor impulso hacia la creación de Ensayos de detección de ligando GPCR. Hacia este esfuerzo, describimos la aplicación de uno de esos recursos, la plataforma PRESTO-Tango, un sistema basado en reporteros de luciferasa que permite el interrogatorio paralelo y simultáneo del GPCR-ome humano, una hazaña que anteriormente se consideraba técnica y económicamente inviable. Sobre la base de un ensayo de reclutamiento independiente de proteínaS G, la universalidad del tráfico mediado por la toma de la empresa y la señalización en los GPCR hace de PRESTO-TANGO una herramienta adecuada para estudiar aproximadamente 300 receptores huérfanos. La sensibilidad y robustez de PRESTO-Tango lo hacen adecuado para pantallas primarias de alto rendimiento que utilizan bibliotecas compuestas, empleadas para descubrir nuevos objetivos GPCR para medicamentos conocidos o para descubrir nuevos ligandos para receptores huérfanos.

Introducción

Los receptores acoplados a proteínas G (GPCR) constituyen la familia más grande y diversa de proteínas transmembranas, que funcionan como interfaces de comunicación entre una célula y su entorno¹. La versatilidad de los GPCR se destaca por su capacidad para detectar una amplia gama de ligandos, desde neurotransmisores hasta nucleótidos, péptidos a fotones, y muchos más, así como su capacidad para regular numerosas cascadas de señalización aguas abajo implicadas en el crecimiento celular, migración, diferenciación, apoptosis, disparo celular, etc.^2,3. Teniendo en cuenta su ubicuidad e im....

Protocolo

1. Examen primario: cultivo celular y sembrado de placas

1. Para preparar placas recubiertas de poli-L-lisina (PLL), dispensar 20 l/bien de una solución de material de 25 g/ml de PLL en placas inferiores ópticas de 384 pocillos blancos o negros utilizando una pipeta electrónica multicanal o un dispensador de reactivos. Incubar las placas a temperatura ambiente durante 0,5–2 h.
   NOTA: Si utiliza las placas negras de 384 pocillos, espere que la señal de fondo sea inferior en comparación con las placas blancas. Se recomiendan placas negras para reducir el sangrado de luminiscencia entre pozos adyacentes.
2. Para conservar las placas recubiertas y lavar el....

Resultados

Utilizando el protocolo PRESTO-Tango presentado en este documento, un extracto de gráulo de cromafina (CG) se basó en 168 objetivos GPCR no olfativos, siendo la mayoría receptores huérfanos. La elaboración de perfiles de dicho extracto se llevó a cabo examinando la movilización de la lista 2 en los receptores elegidos, sobre la base del principio diseñado por Barnea et al.¹⁸ (Figura 1). El ADN plasmico de los GPCR de interés fue tomado del kit GPCR PRESTO-Tango y mont.......

Discusión

Los GPCR dinámicos de conformación son potencias de transducción de señales. Las propiedades fisioquímicas de los bolsillos de unión de estos receptores hephelicales, así como su relevancia fisiológica subrayan la necesidad de herramientas de detección de ligando GPCR. Como se presentó anteriormente, el ensayo PRESTO-Tango es rápido, sensible y fácil de usar, prestándose al desarrollo de drogas. Este ensayo no sólo mide la activación inducida por agonistas, sino que también se puede utilizar para cuantificar la actividad.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
384 Placas Inferiores Ópticas para Pocillos, Base de Polímero de Poliestireno, Tratamiento para Cultivos Celulares, NEGRO, con Tapa, Estériles	NUNC	12-566
384 Placas Inferiores Ópticas para Pocillos, Base Poliestireno Polímero, Tratadas para Cultivos Celulares, Blancas, con Tapa, Estériles	NUNC	12-566-1
384 Pocillos, Fondo Redondo, Polipropileno, Sin Tratar, Azul, No Estéril, Sin Tapa	ThermoFisher	12-565-390
Antibiótico-Antimicótico	Wisent	450-115-EL
D-Luciferina, sal sódica	GoldBio	LUCNA
DMEM con L-Glutamina, 4,5g/L de glucosa y piruvato de sodio	Corning	10-013-CV
Eppendorf Xplorer, 12 canales, variable, 15– 300 y micro; L	Eppendorf	4861000155
Eppendorf Xplorer, 12 canales, variable, 5– 100 y micro; L	Eppendorf	4861000139
Matrix Platemate 2x3	ThermoFisher	801-10001
MicroBeta 1450 Wallac	Perkin Elmer
Penicilina-Estreptomicina	Wisent	450-201-EL
Hidrobromuro de poli-L-lisina	Millipore-Sigma	P2636-500MG
Roth Lab PRESTO-Tango GPCR Kit	Addgene	Kit #1000000068