Describimos una inyección intracisternal que emplea una aguja doblada en la punta que se puede estabilizar en el cráneo, eliminando así el riesgo de daño al parénquima subyacente. El enfoque se puede utilizar para la cartografía genética del destino y manipulaciones de células leptomeningeales y para el seguimiento del movimiento del líquido cefalorraquídeo.
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Artículo de método
Inducción de células leptomeningeales Modificación a través de inyección intraciternal
En este artículo
Resumen
Resumen
El protocolo descrito aquí describe cómo inyectar soluciones de forma segura e manual a través de la cisterna magna, al tiempo que se elimina el riesgo de daño al parénquima subyacente. Los protocolos publicados anteriormente recomiendan el uso de agujas rectas que deben reducirse a un máximo de 1-2 mm de la superficie dura. La caída repentina de la resistencia una vez perforada la membrana dura hace que sea difícil mantener la aguja en una posición estable. Nuestro método, en cambio, emplea una aguja doblada en la punta que se puede estabilizar contra el hueso occipital del cráneo, evitando así que la jeringa penetre en el tejido después de la perforación de la membrana dural. El procedimiento es sencillo, reproducible y no causa molestias duraderas en los animales operados. Describimos la estrategia de inyección intracisternal en el contexto de la cartografía genética del destino de las células leptomeningeales vasculares. La misma técnica puede, además, utilizarse para abordar una amplia gama de cuestiones de investigación, como el sondeo del papel de los leptomeninges en el neurodesarrollo y la propagación de la meningitis bacteriana, a través de la ablación genética de genes implicados putativamente en estos fenómenos. Además, el procedimiento se puede combinar con un sistema de perfusión automatizado para un parto constante y se utiliza para el seguimiento del movimiento del líquido cefalorraquídeo a través de la inyección de moléculas etiquetadas fluorescentesmente.
Introducción
Las células leptomeningeales son una población similar a los fibroblastos de células organizadas en una capa delgada que superpone el cerebro y expresa genes implicados en la reticulación de colágeno (por ejemplo, Dcn y Lum),y en el establecimiento de una barrera cerebro-meningeal (por ejemplo, Cldn11)1,2. Las células leptomeningeales están implicadas en una amplia gama de funciones fisiológicas, desde un estricto control sobre el drenaje del líquido cefalorraquídeo3 hasta la guía de progenitores neuronales en el cerebro en desarrollo4<....
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Protocolo
Los procedimientos quirúrgicos presentados por la presente fueron aprobados por Stockholms Norra Djurf-rs-ksetiska N'mnd y llevados a cabo de acuerdo con las especificaciones proporcionadas por el Instituto de Investigación (Instituto Karolinska, Suecia).
NOTA: La inyección intracisternal se puede adaptar de forma flexible para múltiples fines de investigación. A continuación presentamos un procedimiento desarrollado para etiquetar eficientemente las células leptomeningeales para el mapeo del destino basado en la inyección de endoxifeno en una línea de ratón transgénica que transporta R26R-tdTomato12....
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Resultados
La inyección intracisternal de endoxifeno en ratones transgénicos que expresaN CreER bajo el promotor Cx3013 y un reportero fluorescente inducible permite una recombinación específica de células leptomeningeales sin etiquetar la superficie vecina de expresión Cx30 y los astrocitos parénquimas en la corteza(Figura 1). Con el fin de acceder a la cisterna magna, el animal anestesiado se coloca con su cuerpo y su cabeza en un ángulo de apr.......
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Discusión
El protocolo descrito aquí presenta un procedimiento sencillo y reproducible para etiquetar células leptomeningeal es para la cartografía del destino. Utilizamos la inyección intracisternal de endoxifeno, un metabolito activo de tamoxifeno, para inducir la expresión del reportero fluorescente tdTomato en Cx30-CreER; R26R-tdTomato ratones12,13.
En comparación con otros protocolos utilizados para acceder al líquido cefalorraquídeo a trav.......
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Divulgaciones
Los autores no declaran intereses en competencia.
Agradecimientos
Este estudio fue apoyado por subvenciones del Consejo Sueco de Investigación, la Sociedad Sueca contra el Cáncer, la Fundación Sueca para la Investigación Estratégica, Knut och Alice Wallenbergs Stiftelse y el Programa de Investigación Estratégica en Células Madre y Medicina Regenerativa en Karolinska Institutet (StratRegen).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Unidad de anestesia | Univentor 410 | 8323102 | Completo de vaporizador, cámara y tubo que se conecta a la cámara y al soporte de la cabeza del ratón |
| Anestesia (Isoflurano) | Baxter Medical AB | 000890 | |
| Betadine | Sigma-Aldrich | PVP1 | |
| Carprofeno | Orion Pharma AB | 014920 | Nombre comercial Rymadil |
| Pegamento de cianoacrilato | Carl Roth | 0258.1 | Utilice suturas de seda 5-0, en alternativa |
| Medbond Tissue Glue | Stoelting | 50479 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Endoxifen | Sigma-Aldrich | E8284 | |
| Etanol 70% | Histolab | 01370 | |
| Jeringa Hamilton (aguja biselada de 30 G) | Hamilton | 80300 | |
| Lidocaine | Aspen Nordic | 520455 | |
| Soporte para cabeza de ratón | Narishige International | SGM-4 | Con boquilla para anhestetica inhalatoria. Alternativamente, use un marco estereotáctico |
| Tijeras | Fine Science Tools | 15009-08 | |
| Afeitadora | Aesculap | GT420 | |
| Lanzas de absorción estériles Fine | Science Tools | 18105-01 | Los bastoncillos de algodón estériles también son una buena opción |
| Separador quirúrgico | World Precision Instrument | Pinzas 501897 | |
| Dumont | 11251-35 | ||
| Viscotears | Bausch& Lomb Nordic AB | 541760 |
Referencias
- Vanlandewijck, M., et al. A molecular atlas of cell types and zonation in the brain vasculature. Nature. 554 (7693), 475-480 (2018).
- Whish, S., et al. The inner CSF-brain barrier: developmentally controlled access to t....
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Reimpresiones y permisos
