Синтез Aptamer-PEI-g-PEG Модифицированные золотые наночастицы загружены доксорубицином для целевой доставки лекарств
Summary
В этом протоколе модифицированные наночастицы из золота, загруженные доксорубицином AS1411-g-PEI-g-PEG, синтезируются с помощью трехступчатых реакций амиде. Затем доксорубицин загружается и доставляется в целевые раковые клетки для лечения рака.
Abstract
Из-за лекарственной устойчивости и токсичности в здоровых клетках, использование доксорубицина (DOX) было ограничено в клинической терапии рака. Этот протокол описывает проектирование поли (этиленимин) привиты полиэтиленгликоль (PEI-g-PEG) кополимер функциональных наночастиц золота (AuNPs) с загруженным aptamer (AS1411) и DOX через амиде реакций. AS1411 специально связан с целевыми нуклеолиновых рецепторов на раковых клетках, так что DOX цели раковых клеток, а не здоровых клеток. Во-первых, ПЕГ карбоксилируется, а затем привит в разветвленной PEI для получения КОПОлимер PEI-g-PEG, что подтверждается анализом 1H NMR. Далее синтезируются кополимеры PEI-g-PEG с покрытием золотых наночастиц (PEI-g-PEG@AuNPs), а DOX и AS1411 постепенно соотносяты с AuNPs через реакции амиде. Диаметр подготовленного AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs составляет 39,9 нм, с потенциалом zeta -29,3 мВ, что указывает на то, что наночастицы стабильны в воде и клеточной среде. Анализы цитотоксии клеток показывают, что недавно разработанные DOX загруженные AUNPs способны убивать раковые клетки (A549). Этот синтез демонстрирует деликатное расположение кополицей PEI-g-PEG, aptamers и DOX на AuNPs, которые достигаются последовательными реакциями на фоне. Такие aptamer-PEI-g-PEG функционализированные AuNPs обеспечивают перспективную платформу для целевой доставки лекарств в терапии рака.
Introduction
Будучи основной проблемой общественного здравоохранения во всем мире, рак широко характеризуется как имеющие низкий уровень излечения, высокий уровень рецидивов, ивысокий уровень смертности 1,2. Текущие традиционные противоопухоотные методы включают хирургию, химиотерапиюи лучевую терапию 3,среди которых химиотерапия является основным методом лечения онкологических больных вклинике 4. Клинические препараты, используемые противораковые препараты в основном включают паклитаксел (PTX)5 и доксорубицин (DOX)6,7. DOX, антинеопластический препарат, широко применяется в клинической химиотерапии, из-за преимуществ цитотоксичности рака и ингибирования пролиферациираковых клеток 8,9. Тем не менее, DOX вызываеткардиотоксичность 10,11, и короткий период полуиссяка DOX ограничивает его применение в клинике12. Таким образом, разлагаемые носители наркотиков необходимы для загрузки DOX и субекентно выпускать в контролируемой форме в целевую область.
Наночастицы широко используются в целевых системах доставки лекарств и имеют ряд преимуществ в лечении рака (т.е. значительное соотношение поверхности к объему, небольшой размер, способность инкапсулировать различные препараты, и настраиваемая химия поверхности и т.д.) 13,14,15. В частности, золотые наночастицы (AUNPs) широко используются в биологических и биомедицинских приложениях, таких как фототермальнаятерапия рака 16,17. Уникальные свойства AuNPs, такие как поверхностный синтез и общая функционализация поверхности, имеют отличные перспективы в клинической области терапии рака18. Кроме того, AUNPs были использованы для выявления стратегий доставки лекарств, диагностики опухолей, и преодолеть устойчивостьво многих исследованиях 19,20.
Несмотря на это, AuNPs должны быть дополнительно адаптированы для преодоления лекарственной устойчивости через высокий местный релиз при поражениях опухоли за счет повышения пронизывания и удержания (EPR), таких как ориентации и доступности свойства. Полимерные функционализированные АУН обладают уникальными преимуществами, такими как улучшение водонепроницаемости гидрофобных противораковых препаратов и длительноевремя циркуляции 21,22. Различные биосовместимые полимеры были использованы для покрытий AuNP, таких как полиэтиленгликоль (PEG), полиэтилен (PEI), гиалуроновая кислота, гепарин и ксантановая резинка. Тогда стабильность, а также полезная нагрузка, AUNPs улучшается хорошо23. В частности, PEI является высоко разветвленной полимер, который состоит из многих повторяющихся единиц первичных, вторичных и третичных аминов24. PEI имеет отличную завихреемость, низкую вязкость и высокую степень функциональности, которая подходит для покрытия на AUNPs.
С другой стороны, противоопухолевая препараты должны быть доставлены в раковые клетки непосредственно с улучшенной эффективностью загрузки, и с более низкой токсичностью для лечения первичных и передовыхметастатических опухолей 25. Целевые лиганды имеют большой потенциал для противоопухохоных препаратов целевых системдоставки 26. Его избирательность для связывания целевых молекул придает противоопухохоковой препарат ориентации специфики и увеличивает обогащение наркотиков в больныхтканях 27. Больше лигандов включают антитела, полипептиды и небольшие молекулы. По сравнению с другими лигандами, квитамеры нуклеиновой кислоты могут быть синтезированы в пробирке и легко модифицируются. AS1411 является неизмененным 26 bp фосфодитер олигонуклеотид, который образует стабильную димерик G-тетрамер структуры специально связываться с переэкспрессии целевой рецептор ядерного белкана раковых клетках 28,29,30. AS1411 подавляет пролиферацию многих раковых клеток, но не влияет на ростздоровых клеток 31,32. В результате, AS1411 был использован для изготовления идеальной целевой системы доставки наркотиков.
В этом исследовании, PEI-g-PEG кополимер синтезируется через реакцию амиде, то PEI-g-PEG кополимер покрытием золотых наночастиц (PEI-g-PEG@AuNPs) изготовлены. Кроме того, DOX и AS1411 последовательно связаны с подготовленным PEI-g-PEG@AuNPs, как показано на рисунке 1. Этот подробный протокол призван помочь исследователям избежать многих распространенных ловушек, связанных с изготовлением новых PEI-g-PEG@AuNPs загруженных DOX и AS1411.
Protocol
Representative Results
Discussion
Спектр 1НМР H(рисунок 2) подтверждает успешный синтез кополимера CT-PEG и кополимера PEI-g-PEG. Молекулярные веса PEG и PEI были 1000 и 1200, соответственно. Кроме того, каталитическая система EDC/NHS использовалась для синтеза кополимера PEI-g-PEG с помощью реакций амида. Следует отмети?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование финансировалось Национальным фондом естественных наук Китая (31700840); Ключевой научно-исследовательский проект провинции Хэнань (18B430013, 18A150049). Это исследование было поддержано программой ученых Нанху для молодых ученых XYNU. Авторы хотели бы поблагодарить студента бакалавриата Зебо Цу из Колледжа наук о жизни в XYNU за его полезные работы. Авторы хотели бы отметить Аналитический и испытательный центр XYNU за использование их оборудования.
Materials
| 4-Dimethylaminopyridine | Macklin | D807273 | |
| A549 cell | ATCC CCL-185TM | ||
| AS1411 | BBI Life Sciences Corporation | 5'-d (TTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG) FL-AS1411 (fluorophore-labeled AS1411) | |
| Anhydrous Tetrahydrofuran (THF) | SinoPharm Chemical Reagent Co., Ltd | ||
| Cell counting kit-8 (CCK-8) | Sigma Aldrich | 96992-500TESTS-F | |
| Dichloromethane | Traditional Chinese medicine | 80047318 | |
| Diethyl ether (Et2O) | SinoPharm Chemical Reagent Co., Ltd | ||
| Dimethyl sulfoxide | Macklin | D806645 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) | Sigma Aldrich | ||
| Doxorubicin hydrochloride | Rhawn | R017518 | |
| Ether absolute | Traditional Chinese medicine | 80059618 | |
| Field Emission Transmission Electron Microscope | FEI Company | Tecnai G2 F 20 | |
| Gold(III) chloride trihydrate | Rhawn | R016035 | |
| Laser Particle-size Instrument | Malvern Instruments Ltd | ZetasizerNanoZS/Masterszer3000E | |
| Microplate Reader | Molecular Devices | SpectraMax 190 | |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride | Macklin | N808856 | |
| N-Hydroxysuccinimide | Macklin | H6231 | |
| NMR software | Delta 5.2.1 | ||
| Nuclear Magnetic Resonance Spectrometer | JEOL | JNM-ECZ600R/S3 | |
| Origin 8.5 | OriginLab | ||
| Penicillin | Sigma Aldrich | V900929-100ML | |
| Phosphate-buffered saline | Sigma Aldrich | P4417-100TAB | |
| Poly(ethylene glycol) | Sigma Aldrich | 81188 | BioUltra, average Mn ~ 1000 |
| Poly (ethyleneimine) solution | Sigma Aldrich | 482595 | average Mn ~ 1200, 50 wt.% in H2O |
| Sodium borohydride, powder | Acros | C18930 | |
| Streptomycin | Sigma Aldrich | 85886-10ML | |
| Succinic anhydride | Traditional Chinese medicine | 30171826 | |
| Tetrahydrofuran | Traditional Chinese medicine | 40058161 | |
| Triethylamine | Traditional Chinese medicine | 80134318 | |
| UV/VIS/NIR Spectrometer | Lambda950 | Lambda950 | |
| X-ray Photoelectron Spectrometer | Thermo Fisher Scientific | K-ALPHA 0.5EV |
Referencias
- Abad, J. M., Bravo, I., Pariente, F., Lorenzo, E. Multi-tasking base ligand: a new concept of AuNPs synthesis. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 408 (9), 2329-2338 (2016).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2019. CA-A Cancer Journal for Clinicians. 69 (1), 7-34 (2019).
- Jang, B., Kwon, H., Katila, P., Lee, S. J., Lee, H. Dual delivery of biological therapeutics for multimodal and synergistic cancer therapies. Advanced Drug Delivery Reviews. 98, 113-133 (2016).
- Gansler, T., et al. Sixty years of CA: a cancer journal for clinicians. CA-A Cancer Journal for Clinicians. 60 (6), 345-350 (2010).
- Li, J., et al. Molecular Mechanism for Selective Cytotoxicity towards Cancer Cells of Diselenide-Containing Paclitaxel Nanoparticles. International Journal of Biological Sciences. 15 (8), 1755-1770 (2019).
- Zhao, D., et al. Precise ratiometric loading of PTX and DOX based on redox-sensitive mixed micelles for cancer therapy. Colloids Surfaces B: Biointerfaces. 155, 51-60 (2017).
- Blum, R. H., Carter, S. K. Adriamycin. A new anticancer drug with significant clinical activity. Annals of Internal Medicine. 80 (2), 249-259 (1974).
- de Lima, R. D. N., et al. Low-level laser therapy alleviates the deleterious effect of doxorubicin on rat adipose tissue-derived mesenchymal stem cells. Journal of Photochemistry Photobiology B. 196, 111512 (2019).
- Markowska, A., Kaysiewicz, J., Markowska, J., Huczynski, A. Doxycycline, salinomycin, monensin and ivermectin repositioned as cancer drugs. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 29 (13), 1549-1554 (2019).
- Songbo, M., et al. Oxidative stress injury in doxorubicin-induced cardiotoxicity. Toxicology Letters. 307, 41-48 (2019).
- Ewer, M. S., Ewer, S. M. Cardiotoxicity of anticancer treatments. Nature Reviews Cardiology. 12 (9), 547-558 (2015).
- Gabizon, A., Shmeeda, H., Barenholz, Y. Pharmacokinetics of pegylated liposomal Doxorubicin: review of animal and human studies. Clinical Pharmacokinetics. 42 (5), 419-436 (2003).
- Xu, X., Ho, W., Zhang, X., Bertrand, N., Farokhzad, O. Cancer nanomedicine: from targeted delivery to combination therapy. Trends in Molecular Medicine. 21 (4), 223-232 (2015).
- Feng, S., Nie, L., Zou, P., Suo, J. Effects of drug and polymer molecular weight on drug release from PLGA-mPEG microspheres. Journal of Applied Polymer Science. 132 (6), 41431 (2015).
- Chen, D., et al. Injectable Temperature-sensitive Hydrogel with VEGF Loaded Microspheres for Vascularization and Bone Regeneration of Femoral Head Necrosis. Materials Letters. 229, 138-141 (2018).
- Abadeer, N. S., Murphy, C. J. Recent Progress in Cancer Thermal Therapy Using Gold Nanoparticles. The Journal of Physical Chemistry C. 120 (9), 4691-4716 (2016).
- Riley, R. S., Day, E. S. Gold nanoparticle-mediated photothermal therapy: applications and opportunities for multimodal cancer treatment. WIREs Nanomedicine and Nanobiotechnology. 9 (4), 1449 (2017).
- Fratoddi, I., et al. Highly Hydrophilic Gold Nanoparticles as Carrier for Anticancer Copper(I) Complexes: Loading and Release Studies for Biomedical Applications. Nanomaterials (Basel). 9 (5), 772 (2019).
- Lee, S. M., et al. Drug-loaded gold plasmonic nanoparticles for treatment of multidrug resistance in cancer. Biomaterials. 35 (7), 2272-2282 (2014).
- Dreaden, E. C., Alkilany, A. M., Huang, X., Murphy, C. J., El-Sayed, M. A. The golden age: gold nanoparticles for biomedicine. Chemical Society Reviews. 41 (7), 2740-2779 (2012).
- Wei, T., et al. Anticancer drug nanomicelles formed by self-assembling amphiphilic dendrimer to combat cancer drug resistance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (10), 2978-2983 (2015).
- Galluzzi, L., Buque, A., Kepp, O., Zitvogel, L., Kroemer, G. Immunological Effects of Conventional Chemotherapy and Targeted Anticancer Agents. Cancer Cell. 28 (6), 690-714 (2015).
- Muddineti, O. S., Ghosh, B., Biswas, S. Current trends in using polymer coated gold nanoparticles for cancer therapy. International Journal of Pharmaceutics. 484 (1-2), 252-267 (2015).
- Hu, W., et al. Methyl Orange removal by a novel PEI-AuNPs-hemin nanocomposite. Journal of Environmental Sciences. 53, 278-283 (2017).
- Gu, F. X., et al. Targeted nanoparticles for cancer therapy. Nano Today. 2 (3), 14-21 (2007).
- Srinivasarao, M., Galliford, C. V., Low, P. S. Principles in the design of ligand-targeted cancer therapeutics and imaging agents. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (3), 203-219 (2015).
- Liu, Z., Shi, Y., Chen, Z., Duan, L., Wang, X. Current progress towards the use of aptamers in targeted cancer therapy. Chinese Science Bulletin (Chinese Version). 59 (14), 1267 (2014).
- Ghosh, P., Han, G., De, M., Kim, C. K., Rotello, V. M. Gold nanoparticles in delivery applications. Advanced Drug Delivery Reviews. 60 (11), 1307-1315 (2008).
- Vandghanooni, S., Eskandani, M., Barar, J., Omidi, Y. Antisense LNA-loaded nanoparticles of star-shaped glucose-core PCL-PEG copolymer for enhanced inhibition of oncomiR-214 and nucleolin-mediated therapy of cisplatin-resistant ovarian cancer cells. International Journal of Pharmaceutics. 573, 118729 (2020).
- Andghanooni, S., Eskandani, M., Barar, J., Omidi, Y. AS1411 aptamer-decorated cisplatin-loaded poly(lactic-co-glycolic acid) nanoparticles for targeted therapy of miR-21-inhibited ovarian cancer cells. Nanomedicine. 13 (21), 2729-2758 (2018).
- Palmieri, D., et al. Human anti-nucleolin recombinant immunoagent for cancer therapy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (30), 9418-9423 (2015).
- Pichiorri, F., et al. In vivo NCL targeting affects breast cancer aggressiveness through miRNA regulation. Journal of Experimental Medicine. 210 (5), 951-968 (2013).
- Hou, S., McCauley, L. K., Ma, P. X. Synthesis and erosion properties of PEG-containing polyanhydrides. Macromolecular Bioscience. 7 (5), 620-628 (2007).
- Nie, L., et al. Injectable Vaginal Hydrogels as a Multi-Drug Carrier for Contraception. Applied Sciences. 9 (8), 1638 (2019).
- Zou, P., Suo, J., Nie, L., Feng, S. Temperature-responsive biodegradable star-shaped block copolymers for vaginal gels. Journal of Materials Chemistry. 22 (13), 6316-6326 (2012).
- Etrych, T., Šubr, V., Laga, R., Říhová, B., Ulbrich, K. Polymer conjugates of doxorubicin bound through an amide and hydrazone bond: Impact of the carrier structure onto synergistic action in the treatment of solid tumours. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 58, 1-12 (2014).
- Safari, F., Tamaddon, A. M., Zarghami, N., Abolmali, S., Akbarzadeh, A. Polyelectrolyte complexes of hTERT siRNA and polyethyleneimine: Effect of degree of PEG grafting on biological and cellular activity. Artificial Cells, Nanomedicine, and Biotechnology. 44 (6), 1561-1568 (2016).
