Describimos un método confiable para la preparación de extractos de células enteras a partir de levadura u otras células utilizando un molino congelador criogénico que minimiza la degradación y desnaturalización de proteínas. Los extractos celulares son adecuados para la purificación de complejos proteómicos funcionales, análisis proteómicos, estudios de inmunoprocipitación y detección de modificaciones de proteínas lábiles.
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Artículo de método
Preparación de extractos celulares mediante criogrinding en un molino congelador automatizado
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En este artículo
Resumen
Resumen
La facilidad de manipulación genética y la fuerte conservación evolutiva de la maquinaria celular eucariota en la levadura en ciernes Saccharomyces cerevisiae la ha convertido en un organismo modelo genético preeminente. Sin embargo, dado que el aislamiento eficiente de las proteínas depende de una interrupción óptima de las células, el uso de levadura para el análisis bioquímico de las proteínas celulares se ve obstaculizado por su pared celular, que es costosa de digerir enzimáticamente (usando lyticase o zymolyase), y difícil de interrumpir mecánicamente (usando un batidor de cuentas tradicional, una prensa francesa o una trituradora de café) sin causar calentamiento de muestras, lo que a su vez causa denatura y degradación de proteínas. Aunque la molienda manual de células de levadura bajo nitrógeno líquido (LN2) utilizando un mortero y un peste evita el sobrecalentamiento de las muestras, es intensiva en mano de obra y está sujeta a variabilidad en la lisis celular entre los operadores. Durante muchos años, hemos estado preparando con éxito extractos de levadura de alta calidad utilizando criogrinding de células en un molino congelador automatizado. La temperatura de -196 oC alcanzada con el uso de LN2 protege el material biológico de la degradación por proteasas y nucleasas, permitiendo la recuperación de proteínas intactas, ácidos nucleicos y otras macromoléculas. Aquí describimos esta técnica en detalle para las células de levadura en ciernes que implica primero congelar una suspensión de células en un tampón de lisis a través de su adición por gotas en LN2 para generar gotas congeladas de células conocidas como "palomitas de maíz". Estas palomitas de maíz se pulverizan bajo LN2 en un molino congelador para generar un extracto congelado "en polvo" que se descongela lentamente y se clarifica por centrifugación para eliminar los desechos insolubles. Los extractos resultantes están listos para aplicaciones posteriores, como purificación de proteínas o ácidos nucleicos, análisis proteómicos o estudios de inmunoprocipitación. Esta técnica es ampliamente aplicable para la preparación de extractos celulares de una variedad de microorganismos, tejidos vegetales y animales, especímenes marinos incluyendo corales, así como el aislamiento de ADN / ARN de especímenes fósiles forenses y permafrost.
Introducción
La levadura es un organismo modelo popular para los estudios de proteínas, ya que es un organismo eucariota simple con una abundancia de herramientas genéticas y bioquímicas disponibles para los investigadores1. Debido a su robusta pared celular, un desafío que enfrentan los investigadores es en la eliminación eficiente de las células sin dañar el contenido celular. Se dispone de diferentes métodos para la obtención de extractos proteicos mediante la interrupción de las células de levadura que incluyen lisis enzimática (zymolyase)2,3, lisis química4, lisis física....
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Protocolo
1. Preparación de palomitas de maíz de levadura
- Cultivar células de levadura en 0,5 L de medios YPD a una densidad de 1 x 107 células/ml. Cuente las células utilizando un contador coulter o cualquier otro medio.
- Células centrífugas durante 10 min a 2.400 g y 4oC.
- Lave cada muestra una vez con 500 ml de agua desionizada en frío de 18 mega Ohm Milli-Q.
- Pellets de resuspendición en 15 mL de tampón de lisis helada [20 mM HEPES-KOH pH 7.5, 110 mM KCl, 0.1% Tween, 10% glicerol, con agente reductor 10 mM 10 mM β-mercaptoetanol, cóctel inhibidor de la proteasa, inhibidor de 10 M de inhibidor de proteasoma MG-132, inhibidor de....
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Resultados
Comparamos dos métodos diferentes para la lelisis de células de levadura, a saber, el fresado de cuentas de vidrio a 4 oC y un método automatizado de criogrinding a -196 oC, para evaluar las proteínas de recuperación relativa en los extractos celulares preparados con ambos métodos. Para este estudio, elegimos usar una cepa de levadura en ciernes YAG 1177 (MAT a lys2-810 leu2-3,-112 ura3-52 his3-200 trp1-1[am] ubi1-1::TRP1 ubi-2::ura3 1ubi3-Uub-2 ubi4-2::LEU2 [pUB39] [pUB221])
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Discusión
Una limitación del estudio de las proteínas nativas de la levadura es la lisis ineficiente de las células de levadura debido a su pared celular resistente. Aunque se han desarrollado varios métodos, el método más consistente y eficiente en nuestras manos es el criogrinding de las células de levadura flash congelado como palomitas de maíz. Este método permite la preparación confiable de extractos de células enteras de alta calidad de levadura en ciernes en comparación con otros métodos de lysis. Los resultados representat.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
La investigación en el laboratorio de Gunjan es apoyada por la financiación de los Institutos Nacionales de Salud, la Fundación Nacional de Ciencias y el Departamento de Salud de Florida. Agradecemos al estudiante de pregrado John Parker por la asistencia técnica.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Tubos de policarbonato de 50 mL con tapones de rosca | Beckman | 357002 | Tubos de centrífuga |
| BD Bacto Peptona | BD Biosiences 211677 | Levadura YPD componente de medios | |
| BD Bacto Extracto de levadura | BD Biosiences | 212750 | Levadura YPD componente de medios |
| Beckman Centrífuga Avanti | Beckman | B38624 | Centrífuga de alta velocidad |
| Beckman JLA-9.1000 | Beckman | 366754 | Rotor |
| D-(+)-Dextrosa Anhidro | MP Biomedicals | 901521 | Levadura YPD componente de medios |
| Eppendorf A-4-44 | Eppendorf | 22637461 | Rotor de cangilón oscilante |
| Eppendorf centrífuga refrigerada 5810 R | Eppendorf | 22625101 | Centrífuga refrigerada |
| Glicerol | SIGMA-ALDRICH | G5150-1GA | Excluidor de volumen y crioprotector |
| HEPES | FisherBiotech | BP310-100 | Tampón |
| Anticuerpo HIS6 | Novagen | 70796 | Anticuerpo para HIS tag |
| KCl | SIGMA-ALDRICH | P9541-1KG | Sal para mantener la fuerza iónica |
| MG-132 | CALBIOCHEM | 474790 | Inhibidor del proteasoma |
| Cóctel de inhibidores de la fosfatasa | ThermoFisher Scientific | A32957 | Cóctel de inhibidores de la fosfatasa |
| Ponceau S | SIGMA | P7170-1L | Tinción de proteínas |
| Cóctel de inhibidores de la proteasa | ThermoFisher Scientific | A32963 | Cóctel de inhibidores de la proteasa |
| Rotor JLA 25.500 | Beckman | JLA 25.500 | Rotor |
| Butirato de sodio | EM Science | BX2165-1 | Inhibidor de la histona desacetilasa |
| fluoruro de sodio | Sigma-Aldrich | S6521 | Inhibidor de la fosfatasa |
| Vanadato de sodio | MP Biomedicals | 159664 | Inhibidor de la fosfatasa |
| Alfa | Aesar | 13408-09-8 | Inhibidor de la fosfatasa |
| Spex Certiprep 6850 molino de congelación | SPEX Sample Prep | 6850 | Molino de congelación |
| TALON Metal Affinity Resina | BD Biosiences | 635502 | Para la extracción de proteínas marcadas con HIS |
| Tween 20 | VWR International | VW1521-07 | Detergente no iónico |
| β-Mercaptoetanol | AMRESCO | M131-250ML | Agente reductor |
Referencias
- Botstein, D., Chervitz, S. A., Cherry, J. M. Yeast as a model organism. Science. 277 (5330), 1259-1260 (1997).
- Dunn, B., Wobbe, C. R. Preparation of protein extracts from yeast. Current Protocols in Molecular Biology. , Chapter 13, Unit 13 (2001).
- Holm, C., Meeks-Wagner, D. W., Fangman, W. L., Botstein, D.
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Reimpresiones y permisos
