Questo protocollo consente la preparazione di sezioni trasversali di semi di cereali (ad esempio, riso) per l’analisi della morfologia dell’endosperma e del granulo di amido utilizzando la microscopia elettronica a scansione.
I granuli di amido (SG) presentano morfologie diverse a seconda delle specie vegetali, soprattutto nell’endosperma della famiglia delle Poaceae. La fenotipizzazione dell’endosperma può essere utilizzata per classificare i genotipi basati sul morfotipo SG utilizzando l’analisi al microscopio elettronico a scansione (SEM). Gli SG possono essere visualizzati utilizzando SEM tagliando il kernel (pericarpo, strati di aleurone ed endosperma) ed esponendo il contenuto organellare. I metodi attuali richiedono che il chicco di riso sia incorporato in resina plastica e sezionato usando un microtomo o incorporato in una punta di pipetta troncata e sezionato a mano usando una lama di rasoio. Il primo metodo richiede attrezzature specializzate e richiede molto tempo, mentre il secondo introduce una nuova serie di problemi a seconda del genotipo del riso. Le varietà di riso gessoso, in particolare, rappresentano un problema per questo tipo di sezionamento a causa della natura friabile del loro tessuto endospermatico. Qui viene presentata una tecnica per preparare sezioni di riso traslucide e gessose per la microscopia, che richiedono solo punte di pipette e una lama di bisturi. La preparazione delle sezioni entro i confini di una punta di pipetta impedisce all’endosperma del nocciolo di riso di frantumarsi (per fenotipi traslucidi o “vitrei”) e sgretolarsi (per fenotipi gessosi). Utilizzando questa tecnica, è possibile osservare il pattern delle cellule endospermatiche e la struttura di SG intatti.
I granuli di amido (SG) presentano morfologie diverse a seconda della specie vegetale, soprattutto nell’endosperma della famiglia delle Poaceae 1,2. La fenotipizzazione dell’endosperma può essere utilizzata per classificare i genotipi in base al fenotipo SG utilizzando l’analisi al microscopio elettronico a scansione. Gli SG possono essere visualizzati utilizzando la microscopia elettronica a scansione (SEM) tagliando il kernel e allontanando le pareti cellulari dell’endosperma2.
Lo scopo di questa tecnica è quello di preparare facilmente sezioni trasversali di chicchi di riso esclusivamente per la rapida analisi SEM. Lo sviluppo di questa tecnica è stato motivato dalla necessità di un approccio rapido alla sezione trasversale in base al quale i campioni vengono preparati per la microscopia SEM immediatamente prima della visualizzazione utilizzando attrezzature minime.
Questa tecnica prevede l’inserimento del chicco di riso semigreggio nella punta della pipetta per una completa immobilizzazione. Ciò è particolarmente importante quando si sezionino fenotipi di chicchi di riso gessosi, che sono friabili e si sbriciolano facilmente sottopressione 3. La gessosità è una qualità indesiderabile nel riso poiché influisce sull’aspetto del nocciolo e fa sì che il nocciolo si rompa facilmente durante la lucidatura e la macinazione3. La calcaresità si presenta come un’area opaca in una sezione trasversale del nocciolo che può essere osservata ad occhio nudo; a livello microscopico, la gessosità è caratterizzata da piccoli granuli di amido scarsamente confezionati. Le cause di calcare possono essere genetiche4,5 o ambientali6,7.
Le sezioni trasversali dei semi di cereali sono state tradizionalmente preparate utilizzando metodi di fissaggio chimico e sezionamento dopo l’incorporazione del campione nella cera di paraffina o in un’altra matrice solida4,8,9,10. Nel 2010, il metodo Matsushima è stato introdotto come un modo per evitare la preparazione complicata e dispendiosa in termini di tempo del campione di riso4. Questo metodo prevedeva l’inserimento del chicco di riso semigreggio in una punta di pipetta troncata. La punta è tenuta ferma da un trimmer a blocchi e sezioni sottili e parziali dell’endosperma vengono raccolte utilizzando una lama di rasoio portatile. Un’altra tecnica rapida sviluppata nel 2016 ha permesso di sezionare l’intero sottile di un’ampia varietà di semi secchi, comprese le varietà gessose10. Questi metodi hanno motivato lo sviluppo della tecnica rapida qui presentata.
Questa nuova tecnica è appropriata per i ricercatori che desiderano ottenere sezioni trasversali incrociate intatte di chicchi di riso per la fenotipizzazione dell’endosperma e l’analisi morfologica dell’amido utilizzando SEM.
Questo protocollo rappresenta un adattamento del metodo4della punta della pipetta troncata di Matsushima, con diverse modifiche degne di nota: (1) i kernel non vengono assorbiti in nessun punto della tecnica; (2) per preparare le sezioni non sono necessari né un trimmer a blocchi né un ultramicrotomo. In questo studio sono state esaminate una cultivar “traslucida” di tipo selvatico (Oryza sativa L. ssp. japonica cv. Nipponbare) e una linea mutagenizzata “gessosa” di Nipponbare (ssg1, granello di amido scadente1)4. Queste due cultivar sono state selezionate per l’analisi qui per dimostrare le differenze tecniche e visive nella lavorazione di sezioni di riso traslucido e gessoso.
La tecnica qui presentata rappresenta un approccio veloce, semplice e acuto alla preparazione di sezioni trasversali di riso per la visualizzazione SEM desktop. Questa tecnica di sezionamento consente la rapida osservazione della struttura dell’endosperma, della forma, delle dimensioni e del modello delle cellule dell’endosperma, dei granuli composti e della morfologia dell’amido. Ai fini della fenotipizzazione dell’endosperma e dello screening del germoplasma, è fondamentale ottenere un’intera sezione trasversale del nocciolo di riso4,23,24. È fondamentale inserire il nocciolo interamente all’interno della punta della pipetta per evitare che la pressione della lama del bisturi costringa l’endosperma a sgretolarsi o frantumarsi. A condizione che l’assemblaggio del “telescopio” sia costruito correttamente, i campioni possono essere preparati per la visualizzazione entro 15 secondi(Tabella 2)utilizzando materiali già in mano in un tipico ambiente di laboratorio. Questa tecnica è applicabile alla sezione trasversale di qualsiasi seme ellissoidale di circa quattro millimetri di diametro nel suo punto più largo. I semi dell’erba modello Brachypodium distachyon (Figura S2A) possono essere sezionati in modo simile ma non rimangono racchiusi all’interno dell’anulus. I semi più grandi, come il grano, si fratturano facilmente e richiedono cura durante il sezionamento (Figura S2B).
Tuttavia, ci sono diverse limitazioni alla tecnica presentata qui. Le sezioni ottenute con questa tecnica non sono abbastanza sottili da consentire il passaggio della luce, il che vieta l’uso di questa tecnica per approcci microscopici basati sulla luce trasmessa come il campo luminoso (spessore massimo del campione di 500 μm per le sezioni del nocciolo di riso25) e la microscopia elettronica a trasmissione (TEM) (spessore massimo del campione 500 nm26 ). L’uso di una punta di pipetta come “matrice” di sezionamento limita anche la dimensione del seme che può essere sezionato usando questa tecnica. Sarebbe necessaria un’ulteriore risoluzione dei problemi per adattare questa tecnica a specie altamente dissimili dal riso e la dimensione della “matrice” è limitata dalla dimensione delle punte delle pipette disponibili per l’acquisto.
Un altro netto vantaggio che questa tecnica fornisce è la qualità dei campioni che possono essere prodotti da chicchi di riso fenotipo gessoso. Vale la pena notare che anche lo studio di Matsushima ha ammesso che era difficile ottenere sezioni trasversali usando quel particolare metodo per i fenotipi gessosi4, come replicato in questo studio a scopo di confronto (Figura 1S). Nel loro caso, è diventato necessario fissare chimicamente i loro campioni di riso gessoso e incorporarli in resina per il sezionamento. La nuova tecnica, in combinazione con l’imaging SEM desktop, consente al ricercatore di preparare facilmente sezioni trasversali di chicchi di riso per la microscopia con maggiore consistenza rispetto a senza supporto di immobilizzazione(Tabella 3).
Nella nuova era della fenomica e della metabolomica, è importante monitorare le linee mutagenizzate e le librerie con tag di trasposone per comprendere meglio la funzione e l’importanza dell’amido nei semi. Inoltre, la International Rice Genebank detiene oltre 130 000 accessioni di riso27. Una tecnica di fenotipizzazione rapida dei semi come quella qui presentata accelererebbe la classificazione e il campionamento per la qualità nutrizionale28. Infine, questa tecnica può essere utile alla luce dell’invasione degli impatti dei cambiamenti climatici. Lo stress stagionale ad alta temperatura durante il riempimento del grano era già stato identificato come una delle principali cause di calcare6,ma studi recenti hanno implicato l’aumento delle temperature globali nell’aumento della gessosità delle rese di riso7,29. Tale fenotipizzazione accelerata dell’endosperma può aiutare a fornire un’ampia immagine agricola dell’effetto dell’aumento delle temperature globali.
The authors have nothing to disclose.
Gli autori sono grati a Systems for Research (SFR Corp.) per l’uso del loro strumento Phenom ProX Desktop SEM, nonché per l’assistenza tecnica fornita da Maria Pilarinos (Systems for Research (SFR) Corp.) e Chloë van Oostende-Triplet (Cell Biology and Image Acquisition Core Facility, Facoltà di Medicina, Università di Ottawa). Il finanziamento è stato fornito dal Low Carbon Innovation Fund (LCIF) del Ministero dello Sviluppo Economico, della Creazione e del Commercio del Governo dell’Ontario e da Proteins Easy Corp.
JMP 15 | SAS | N/A | N/A |
Leit Adhesive Carbon Tabs 12 mm (Pack of 100) | Agar Scientific | AGG3347N | N/A |
Phenom Pro Desktop SEM | Thermo Scientific | PHENOM-PRO | N/A |
Pipette Tips RC UNV 250 µL | Rainin | 17001116 | N/A |
SEM Pin Stub Ø12.7 Diameter Top, Standard Pin, Aluminium | Micro to Nano | 10-002012-50 | N/A |
Shandon Microdissecting Fine Tips Thumb Forceps, Fine Tips, 12.7 cm | Thermo Scientific | 3120019 | N/A |
Shandon Scalpel Blade No. 20, Sterile, 4.5 cm | Thermo Scientific | 28618256 | N/A |
Shandon Stainless-Steel Scalpel Blade Handle | Thermo Scientific | 5334 | N/A |
Zeiss V20 Discovery Stereomicroscope | Zeiss | N/A | N/A |