Visualización de la interacción de proteínas de reparación del ADN por inmunofluorescencia

Resumen

Después del daño del ADN, las células humanas activan vías de reparación esenciales para restaurar la integridad de su genoma. Aquí, describimos el método de inmunofluorescencia indirecta como un medio para detectar proteínas de reparación del ADN, analizar su reclutamiento espacial y temporal, y ayudar a interrogar la interacción proteína-proteína en los sitios de daño del ADN.

Resumen

Las células de mamíferos están constantemente expuestas a sustancias químicas, radiaciones y subproductos metabólicos de origen natural, que crean tipos específicos de insultos de ADN. Los agentes genotóxicos pueden dañar la columna vertebral del ADN, romperlo o modificar la naturaleza química de las bases individuales. Después del insulto al ADN, se activan las vías de respuesta al daño del ADN (DDR) y se reclutan proteínas implicadas en la reparación. Una gran cantidad de factores están involucrados en la detección del tipo de daño y la activación de la respuesta de reparación adecuada. No activar y reclutar correctamente factores DDR puede conducir a una inestabilidad genómica, lo que subyace a muchas patologías humanas, incluido el cáncer. Los estudios de proteínas DDR pueden proporcionar información sobre la respuesta de fármacos genotóxicos y los mecanismos celulares de resistencia a los medicamentos.

Hay dos formas principales de visualizar las proteínas in vivo:la observación directa, etiquetando la proteína de interés con una proteína fluorescente y siguiéndola por imágenes en vivo, o inmunofluorescencia indirecta en muestras fijas. Mientras que la visualización de proteínas etiquetadas fluorescentemente permite una monitorización precisa con el tiempo, el etiquetado directo en N- o C-terminus puede interferir con la localización o función de la proteína. Se prefiere la observación de proteínas en su versión endógena no modificada. Cuando las proteínas de reparación del ADN son reclutadas para el insulto del ADN, su concentración aumenta localmente y forman grupos, o "foci", que pueden ser visualizados por inmunofluorescencia indirecta utilizando anticuerpos específicos.

Aunque la detección de focos proteicos no proporciona una prueba definitiva de interacción directa, la co-localización de proteínas en las células indica que se reagrupan en el lugar del daño y pueden informar de la secuencia de eventos necesarios para la formación compleja. Un análisis cuidadoso de la superposición espacial de los focos en células que expresan versiones de tipo salvaje o mutantes de una proteína puede proporcionar pistas preciosas sobre dominios funcionales importantes para la función de reparación del ADN. Por último, la co-localización de proteínas indica posibles interacciones directas que pueden ser verificadas por co-inmunoprecipitación en las células, o extracción directa usando proteínas purificadas.

Introducción

Las células humanas están constantemente expuestas a una variedad de agentes dañinos del ADN de diversos orígenes. Las fuentes exógenas consisten principalmente en la exposición a radiaciones, productos químicos (incluidos agentes quimioterápticos y algunos antibióticos) y virus, mientras que las principales fuentes endógenas incluyen errores en la replicación del ADN y el estrés oxidativo. Los efectos directos de la exposición genotóxica pueden variar de una base modificada a una rotura de doble cadena de ADN potencialmente letal (DSB), dependiendo de la tensión y la dosis de exposición. En última instancia, el daño del ADN no reparado o mal reparado puede conducir a....

Protocolo

1. Cultivo celular de HeLa

1. Pretrata los cubreobjetos redondos de vidrio con 1 M HCl a 50oC durante 16-18 horas. Enjuagar con ddH₂O y conservar en 100% EtOH.
2. Preparar el medio de cultivo celular: añadir 10% (v/v) FBS al medio DMEM.
3. Cultivar 4,0 x 10⁴ células/pozo en una placa estéril de 12 pozos con un cubreobjetos de vidrio redondo de 18 mm a 37 oC y 5% de_CO2 en una incubadora humidificada. Crecer las células al 80% de confluencia (aproximadamente 24 horas).

2. Tratamiento celular con radiación (IR)

1. Para inducir la formación de roturas de doble hebra, exponga las....

Resultados

En el día 2, o 24 h después de las células de siembra en los cubreobjetos, las células han sufrido una división y son 80% confluentes. Los derribos o mutaciones específicos en las proteínas de reparación del ADN pueden aumentar el tiempo de duplicación, o sensibilizar a las células al tratamiento genotóxico, y la densidad de siembra, así como las dosis de tratamiento, deben ajustarse en consecuencia. Para determinar las mejores condiciones de trabajo, el tiempo de la respuesta al daño del ADN puede ser establecido por la.......

Discusión

El análisis del momento y la eficiencia de la reparación del daño del ADN por microscopía ha demostrado ser esencial para entender cómo funciona la maquinaria de reparación del ADN, en las células normales y en patologías humanas como el cáncer.

El desarrollo de anticuerpos específicos que permitan la detección de proteínas activadas en su versión fosforilada (como el 10,^{10,23,39,,43.......}

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Solución acuosa de paraformaldehído (PFA) al 16% (v/v) Electrónica	Microscopy Sciences	15710	La calidad de la microscopía del PFA garantiza las mejores imágenes. Si usa "PFA casero", filtre antes de usar.
Albúmina sérica bovina (BSA)	Sigma-Aldrich	A3059	Se recomienda la fracción de choque térmico, para evitar precipitaciones/fondo.
Cubreobjetos #1, redondo de 18 mm (cubreobjetos)	Neuvitro	NC0308920	Los cubreobjetos deben limpiarse y esterilizarse antes de su uso, con HCl o etanol.
DMEM, Alta glucosa [(+) 4,5 g/L D-glucosa, (+) L-glutamina, (-) piruvato de sodio]	Gibco	11965118	Ajuste el medio de cultivo a las necesidades de la línea celular utilizada.
DPBS, sin calcio, sin magnesio	Gibco	14190144	PBS para el cultivo de tejidos.
Etilenglicol-bis(β-aminoethyl éter)-N,N,N′,N′-ácido tetraacético (EGTA)	Research Products International	E57060	Tampón de extracción nuclear.
Suero Fetal Bovino (FBS)	Life Technologies	104370028	La calidad del FBS puede evaluarse mediante el análisis de la formación de focos de gH2AX. Si hay trazas de endotoxina genotóxica en el lote, el gH2AX será positivo en ausencia de estrés.
Cloruro de magnesio (MgCl2)	Research Products International	M24000	Tampón de extracción nuclear.
Piperazina-N, N′-bis(ácido 2-etanosulfónico) (PIPES)	Research Products International	P40150	Tampón de extracción nuclear.
montante antidecoloración SlowFade Diamond con DAPI	Invitrogen	S36973	300 nM DAPI con medio de montaje antidesvanecimiento VECTASHIELD.
Cloruro de sodio (NaCl)	Research Products International	S23020	Tampón de extracción nuclear.
Sacarosa	Research Products International	S24060	Tampón de extracción nuclear.
portaobjetos de microscopio Superfrost Plus	1255015		portaobjetos de polisina.
Placas de pocillos múltiples tratadas con TC, tamaño 12 pocillos	Costar	3513	La siembra en cubreobjetos se realiza en placa de 12 pocillos.
Triton X-100	AmericanBio	AB02025	Tampón de extracción nuclear.
enzima TrypLE Express (1X), el Gibco rojo sin fenol		12604021	la tripsina-EDTA.
tripsina-EDTA (0,5%), sin rojo de fenol	Gibco	15400054	TrypLE.

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