La heterogeneidad intramoral es una característica inherente de los tumores, incluidos los gliomas. Desarrollamos un protocolo simple y eficiente que utiliza una combinación de tampones y centrifugación por gradiente para aislar núcleos individuales de tejidos de glioma frescos congelados para estudios de secuenciación de ARN de núcleo único y ATAC.
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Artículo de método
Aislamiento de núcleos de tumores cerebrales frescos congelados para RNA-seq de un solo núcleo y ATAC-seq
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Resumen
Resumen
Los gliomas difusos adultos exhiben heterogeneidad inter e intratitumoral. Hasta hace poco, la mayoría de los esfuerzos de perfiles moleculares a gran escala se han centrado en enfoques masivos que condujeron a la clasificación molecular de los tumores cerebrales. En los últimos cinco años, los enfoques de secuenciación de células individuales han destacado varias características importantes de los gliomas. La mayoría de estos estudios han utilizado muestras de tumores cerebrales frescos para aislar células individuales utilizando citometría de flujo o métodos de separación basados en anticuerpos. En el futuro, el uso de muestras de tejido fresco congelado de biobancos proporcionará una mayor flexibilidad a las aplicaciones de una sola célula. Además, a medida que avance el campo unicelular, el próximo desafío será generar datos multiómicos a partir de una sola célula o de la misma preparación de muestras para desentrañar mejor la complejidad del tumor. Por lo tanto, los protocolos simples y flexibles que permiten la generación de datos para diversos métodos, como la secuenciación de ARN de un solo núcleo (snRNA-seq) y el ensayo de núcleo único para la cromatina accesible a la transposasa con secuenciación de alto rendimiento (snATAC-seq) serán importantes para el campo.
Los avances recientes en el campo de una sola célula, junto con instrumentos microfluídicos accesibles, como la plataforma genómica 10x, han facilitado las aplicaciones de células individuales en laboratorios de investigación. Para estudiar la heterogeneidad de los tumores cerebrales, desarrollamos un protocolo mejorado para el aislamiento de núcleos individuales de gliomas frescos congelados. Este protocolo combina los protocolos existentes de una sola célula y combina un paso de homogeneización seguido de filtración y centrifugación de gradiente mediado por tampón. Las muestras resultantes son suspensiones puras de núcleos individuales que se pueden utilizar para generar datos de expresión génica de un solo núcleo y accesibilidad a la cromatina a partir de la misma preparación de núcleos.
Introducción
Los gliomas difusos de grado inferior (LGG), el tumor cerebral primario más común en adultos, son neoplasias infiltrativas que a menudo surgen en el hemisferio cerebral. Los LGG exhiben heterogeneidad inter e intratitumoral, que no solo es impulsada por la población tumoral sino también por las células no malignas intrincadamente involucradas en el desarrollo y la progresión del tumor1,2,3,4,5.
Durante la última década, ha habido una avalancha de datos genómicos recopilados en el....
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Protocolo
Se obtuvieron muestras frescas de glioma congeladas del banco de tejidos del Centro Nacional de Enfermedades Tumorales (NCT) en Heidelberg, Alemania. El uso de material para pacientes fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional de la Facultad de Medicina de Heidelberg, y se obtuvo el consentimiento informado de todos los pacientes incluidos en el estudio.
1. Preparación experimental
- Realice todos los pasos sobre hielo o a 4 °C.
- Tubos pre-fríos, platos, cuchillas de afeitar, Douncers y morteros a 4 °C.
- Prepare todos los búferes con anticipación. Estos tampones son estables a temperatura ambiente. Se reco....
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Resultados
La genómica de núcleo único es un campo en evolución con datos y protocolos limitados. Un factor crítico que influye en el resultado de los ensayos de núcleos individuales es el aislamiento de núcleos puros e intactos. Combinamos dos protocolos publicados (protocolos DroNc-seq y Omni-ATAC-seq) para aislar núcleos puros y de alta calidad de bloques de tejido de glioma frescos congelados en un tiempo relativamente corto, manteniendo así la estabilidad de las transcripciones(Figura 1).
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Discusión
El campo de la heterogeneidad intramoral se encuentra en una etapa emocionante, con nuevos ensayos y plataformas que se están desarrollando para desafiar y expandir el conocimiento existente. La heterogeneidad intramoral es un factor crucial que contribuye a la progresión de la enfermedad y a la resistencia a las modalidades de tratamiento actuales en los gliomas28. Estudios recientes sobre tumores cerebrales se han centrado en este importante aspecto mediante el uso de ensayos transcriptómicos y .......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Agradecemos al Single Cell Open Lab (scOpenLab) en el Centro Alemán del Cáncer (DKFZ) por sus útiles discusiones. Esta investigación fue apoyada por la subvención número 70111964 (S.T.) de la Ayuda Alemana contra el Cáncer, Programa Max-Eder.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 2-Mercaptoetanol | Sigma | M6250 | |
| CaCl2 | Sigma 21115-100ML | ||
| Homogeneizador de onzas | Motivo activo | 40401 | |
| EDTA (0,5 m) | Thermo Scientific | R1021 | |
| Falcon 15 mL Tubos de centrífuga cónicos | Fisher Scientific | ||
| Iodixanol (también conocido como Optiprep) | Tecnologías de células madre | 07820 | |
| MACs Smart Strainers (30 µ m) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| MACS SmartStrainers (100 µ m) | Miltenyi Biotec | 130-098-463 | |
| Mg(Ac)2 | Sigma 63052-100ML | ||
| NP-40 | Abcam | ab142227 | |
| Kit de aislamiento de núcleos: Núcleos EZ Prep | Sigma | NUC101-1KT | |
| Fluoruro de fenilmetanosulfonilo (PMSF) | Sigma | P7626 | |
| Filtros de preseparación (20 y micro; m) | Miltenyi Biotec | 130-101-812 | |
| Tubos de bloqueo seguro 1,5 mL | Eppendorf | 0030120086 | |
| Tubos de bloqueo seguro 2,0 mL | Eppendorf | 0030120094 | |
| Single Cell ATAC | 10x Genomics | ||
| Expresión génica de una sola célula | 10x Genomics | ||
| Sacarosa | Sigma | S0389 | |
| Puntas de pipeta de diámetro ancho (1000 y micro; L) | Themo Fisher Scientific | 2079GPK | |
| Puntas de pipeta de diámetro ancho (200 y micro; L) | Themo Fisher Científico | 2069GPK |
Referencias
- Huse, J. T., Holland, E. C. Targeting brain cancer: advances in the molecular pathology of malignant glioma and medulloblastoma. Nature Reviews Cancer. 10 (5), 319-331 (2010).
- Kreso, A., Dick, J. E. Evolution of the cancer stem cell model. Cell Stem Cell
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Reimpresiones y permisos
