Differentiering av monocyter till fenotypiskt distinkta makrofager efter behandling med humant navelsträngsblod stem cell (CB-SC)-Härledda exosomer
Summary
Exosome ansökan är ett framväxande verktyg för läkemedelsutveckling och regenerativ medicin. Vi upprättar en exosome isolering protokoll med hög renhet att isolera exosomer från nya identifierade stamceller som kallas CB-SC för mekanistiska studier. Vi även coculture CB-SC-härledda exosomer med mänskliga monocyter, vilket leder till deras differentiering till fenotypiskt distinkta makrofager.
Abstract
Stem Cell Educator (SCE) terapi är en ny klinisk metod för behandling av typ 1 diabetes och andra autoimmuna sjukdomar. SCE terapi cirkulerar den isolerade patientens blod mononukleära celler (t.ex., lymfocyter och monocyter) genom en aferes maskin, co-kulturer patientens blod mononukleära celler med anhängare navelsträng blod-derived stamceller (CB-SC) i SCE-enheten, och sedan returnerar dessa “utbildade” immunceller till patientens blod. Exosomer är nano-sized extracellulära vesiklar mellan 30\u2012150 nm existerande i alla biofluid och cell kultur media. För att ytterligare utforska molekylära mekanismer som ligger bakom SCE terapi och bestämma åtgärder av exosomer som frigörs från CB-SC, undersöker vi vilka celler som fagocytize dessa exosomer under behandlingen med CB-SC. Genom co-odling Dio-märkt CB-SC-härledda exosomer med humant perifert blod mononukleära celler (PBMC), fann vi att CB-SC-härledda exosomer togs främst upp av mänskliga CD14-positiva monocyter, vilket leder till differentiering av monocyter i typ 2 makrofager (M2), med spindel-liknande morfologi och uttryck för M2-associerade ytan molekylära markörer. Här presenterar vi ett protokoll för isolering och karakterisering av CB-SC-härledda exosomer och protokollet för samkultur av CB-SC-härledda exosomer med mänskliga monocyter och övervakningen av M2 differentiering.
Introduction
Stamceller från navelsträngsblod (CB-SC) är unika typer av stamceller som identifieras från navelsträngsblod och särskiljs från andra kända typer av stamceller såsom mesenkymala stamceller (MSC) och hematopoitiska stamceller (HSC)1. Baserat på deras unika egenskaper immunmodulering och deras förmåga att tätt hålla sig till ytan av Petri rätter, utvecklade vi en ny teknik som utsetts till Stem Cell Educator (SCE) terapi i kliniska prövningar2,3. Under SCE terapi, en patients perifert blod mononuclear celler (PBMC) samlas in och cirkuleras genom en cell separator och co-odlade med anhängare CB-SC in vitro. Dessa “utbildade” celler (CB-SC-behandlade PBMC) sedan återförs till patientens cirkulation i en sluten loop system. Kliniska prövningar har redan visat den kliniska säkerheten och effekten av SCE-behandling för behandling av autoimmuna sjukdomar inklusive typ 1-diabetes (T1D)2,4 och alopecia areata (AA)5.
Exosomer är en familj av nanopartiklar med diametrar som sträcker sig 30\u2012150 nm och finns i alla biofluid och cellkultur media6. Exosomer är berikade med många bioaktiva molekyler inklusive lipider, mRNAs, proteiner och microRNAs (miRNA), och spelar en viktig roll i cell-till-cell kommunikation. På senare tid har exosomer blivit mer attraktiva för forskare och läkemedelsföretag på grund av deras terapeutiska potentialer ikliniker 7,8,9. Nyligen visade våra mekanistiska studier att CB-SC-släppt exosomer bidra till immun modulering av SCE terapi10.
Här beskriver vi protokollet för att utforska mekanismen för SCE terapi inriktning monocyter av CB-SC-släppt exosomer. Först var CB-SC-frisläppt exosomer isolerade från CB-SC-härledda betingade medier med hjälp av metoder ultracentrifugation och valideras av flödescytometri, västra blot (WB) och dynamiska ljusspridning (DLS). Andra, CB-SC-härledda exosomer var märkta med en grön fluorescerande lipophilic färgämne: Dio. För det tredje var de co-odlade med PBMC att undersöka de positiva procentsatserna av Dio-märkt CB-SC-härledda exosomer på de olika subpopulationer av PBMC genom flöde cytometri. Detta protokoll ger vägledning för att studera verkan av exosomer som ligger bakom immunmoduleringen av stamceller.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tillämpning av exosomer är ett framväxande fält för klinisk diagnos, läkemedelsutveckling och regenerativ medicin. Här presenterar vi ett utförligt protokoll angående beredning av CB-SC-härledda exosomer och den funktionella studie av exosomer på differentiering av mänskliga monocyter. Det nuvarande protokollet visat att funktionella CB-SC-härledda exosomer är isolerade genom sekventiell centrifugering och ultracentrifugeringen med hög renhet och uppvisar immunmoduleringen på monocyter.
<p class="jove…Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi är tacksamma mot Mr Poddar och Mr Ludwig för generöst stöd via Hackensack UMC Foundation. Vi uppskattar Laura Zhao för engelsk redigering.
Materials
| 1.5 ml Microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 15 ml conical tube | Falcon | 352196 | |
| 24-well plate | Falcon | 351147 | Non-tissue culture plate |
| 3,3'-Diostadecyloxacarbocyanine perchlorate(Dio) | Millipore sigma | D4292-20MG | Store at 4 °C |
| 300 Mesh Grids | Ted Pella | 1GC300 | |
| 50 mL conical tube | Falcon | 352070 | |
| 6-well plate | Falcon | 353046 | Tissue culture plate |
| 96-well plate | Falcon | 353072 | Tissue culture plate |
| ACK Lysis Buffer | Lonza | 10-548E | 100 ml |
| Amicon-15 10kDa Centrifuge Fliter Unit | Millipore sigma | UFC901024 | |
| Anti-Human Alix | Biolegend | 634501 | store at 4 °C, RRID: AB_2268110 |
| Anti-Human Calnexin | Biolegend | 699401 | store at 4 °C, RRID: AB_2728519 |
| Anti-Human CD11c antibody, Pe-Cy7 | BD Bioscience | 561356 | store at 4 °C, RRID: AB_10611859 |
| Anti-Human CD14 antibody, Karma Orange | Beckman Coulter | B36294 | store at 4 °C, RRID: AB_2728099 |
| Anti-Human CD163 antibody, PE | BD Bioscience | 556018 | store at 4 °C, RRID: AB_396296 |
| Anti-Human CD19 antibody, PC5 | Beckman Coulter | IM2643U | store at 4 °C, RRID: AB_131160 |
| Anti-Human CD206 antibody, FITC | BD Bioscience | 551135 | store at 4 °C, RRID: AB_394065 |
| Anti-Human CD209 antibody, Brilliant Violet 421 | BD Bioscience | 564127 | store at 4 °C, RRID: AB_2738610 |
| Anti-Human CD270 antibody, PE | Biolegend | 318806 | store at 4 °C, RRID: AB_2203703 |
| Anti-Human CD3 antibody, Pacfic Blue | Biolegend | 300431 | store at 4 °C, RRID: AB_1595437 |
| Anti-Human CD34 antibody, APC | Beckman Coulter | IM2427U | store at 4 °C, RRID: N/A |
| Anti-Human CD4 antibody, APC | BD Bioscience | 555349 | store at 4 °C, RRID: AB_398593 |
| Anti-Human CD45 antibody, Pe-Cy7 | Beckman Coulter | IM3548U | store at 4 °C, RRID: AB_1575969 |
| Anti-Human CD56 antibody, PE | Beckman Coulter | IM2073U | store at 4 °C, RRID: AB_131195 |
| Anti-Human CD63 antibody,PE | BD Bioscience | 561925 | store at 4 °C, RRID: AB_10896821 |
| Anti-Human CD8 antibody, APC-Alexa Fluor 750 | Beckman Coulter | A94686 | store at 4 °C, RRID: N/A |
| Anti-Human CD80 antibody, APC | Beckman Coulter | B30642 | store at 4 °C, RRID: N/A |
| Anti-Human CD81 antibody, FITC | BD Bioscience | 561956 | store at 4 °C, RRID: AB_394049 |
| Anti-Human CD86 antibody, APC-Alexa Fluor 750 | Beckman Coulter | B30646 | store at 4 °C, RRID: N/A |
| Anti-Human CD9 antibody, FITC | ThermoScientic | MA5-16860 | store at 4 °C, RRID: AB_2538339 |
| Anti-Human Galectin 9 antibody, Brilliant Violet 421 | Biolegend | 348919 | store at 4 °C, RRID: AB_2716134 |
| Anti-Human OCT3/4 antibody, eFluor660 | ThermoScientic | 50-5841-82 | store at 4 °C, RRID: AB_11218882 |
| Anti-Human SOX2 antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoScientic | 53-9811-82 | store at 4 °C, RRID: AB_2574479 |
| BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23227 | |
| Bovine Serum Albumin | Millipore Sigma | A1933 | |
| Buffy coat | New York Blood Center | 40-60 ml/unit | |
| Cell scraper | Falcon | 353085 | |
| Disposable semi-micro cuvette | VWR | 97000590 | |
| Dissociation buffer | Gibco | 131510014 | 100 ml |
| Dual-Chanber cell counting slides | Bio-Rad | 1450015 | |
| Exosome-Human CD63 Detection reagent | ThermoFisher Scientific | 10606D | store at 4 °C |
| Ficoll-Paque PLUS density grandient media | GE Health | 17-1440-03 | 500 ml |
| Fixed-Angle Rotor(25°) | Thermo Scientifc | 75003698 | Maxium 24,700 x g |
| Gallios flow cytometer | Beckman Coulter | 3 lasers 10 Color Max |
|
| Human cord blood | Cryo-Cell International | 40-100 ml/unit | |
| Human Fc Block | BD Bioscience | 564220 | store at 4 °C |
| Immun-Blot PVDF membrane | Bio-Rad | 1620177 | |
| Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm | Millipore Sigma | SLGP033RS | |
| Optima XE-90 Ultracentriguge | Beckman Coulter | ||
| Orbital Shaker MP4 | BioExpress | S-3500-1 | |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 10010049 | 500 ml |
| Propidium Iodide | BD Bioscience | 56-66211E | store at 4 °C |
| Nikon Eclipse Ti2 microscope | Nikon instruments Inc | Eclipse Ti2 | NIS-Elements software version 5.11.02 |
| Hochest 33342 | Thermo Scientifc | 62249 | 5 ml |
| Revert microsopy | Fisher scientific | 12563518 | |
| Rotor 41 Ti | Beckman Coulter | 331362 | Maxium 41,000 rpm |
| Sorvall St 16R Centrifuge | Thermo Scientifc | 75004381 | |
| Swinging Bucket Rotor | Thermo Scientifc | 75003655 | |
| TC-20 cell counter | Bio-Rad | ||
| ThermoScientific Forma 380 Steri Cycle CO2 Incubator | ThermoFisher Scientific | ||
| Transmission electron microscopy | JEOL | JEM-2100 PLUS | |
| Ultracentrifuge tube | Beckman Coulter | 331372 | |
| X'VIVO 15 Serum-free medium | Lonza | BEBP04-744Q | 1000 ml Culture medium, store at 4 °C |
Referencias
- Zhao, Y. Stem cell educator therapy and induction of immune balance. Current Diabetes Reports. 12 (5), 517-523 (2012).
- Zhao, Y., et al. Reversal of type 1 diabetes via islet beta cell regeneration following immune modulation by cord blood-derived multipotent stem cells. BMC Medicine. 10 (1), 3 (2012).
- Zhao, Y., et al. Targeting insulin resistance in type 2 diabetes via immune modulation of cord blood-derived multipotent stem cells (CB-SCs) in stem cell educator therapy: phase I/II clinical trial. BMC Medicine. 11, 160 (2013).
- Delgado, E., et al. Modulation of autoimmune T-cell memory by stem cell educator therapy: phase 1/2 clinical trial. EBioMedicine. 2 (12), 2024-2036 (2015).
- Li, Y., et al. Hair regrowth in alopecia areata patients following Stem Cell Educator therapy BMC. Medicina. 13 (1), 87 (2015).
- Colombo, M., Raposo, G., Thery, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annual Review of Cell And Developmental Biology. 30, 255-289 (2014).
- Abak, A., Abhari, A., Rahimzadeh, S. Exosomes in cancer: small vesicular transporters for cancer progression and metastasis, biomarkers in cancer therapeutics. PeerJ. 6, 4763 (2018).
- Adamiak, M., Sahoo, S. Exosomes in myocardial repair: advances and challenges in the development of next-generation therapeutics. Molecular Therapy. 26 (7), 1635-1643 (2018).
- Akyurekli, C., et al. A systematic review of preclinical studies on the therapeutic potential of mesenchymal stromal cell-derived microvesicles. Stem Cell Review and Report. 11 (1), 150-160 (2015).
- Hu, W., Song, X., Yu, H., Sun, J., Zhao, Y. Released exosomes contribute to the immune modulation of cord blood-derived stem cells (CB-SC). Frontiers in Immunology. (11), 165 (2020).
- Jacobson, G., Kårsnäs, P. Important parameters in semi-dry electrophoretic transfer. Electrophoresis. 11 (1), 46-52 (1990).
- Dykstra, M. J., Reuss, L. E. . Biological Electron Microscopy: Theory, Techniques, and Troubleshooting. , (2011).
- Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. Isolation of extracellular vesicles: general methodologies and latest trends. BioMed Research International. 2018, 8545347 (2018).
- Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).
- Orecchioni, M., Ghosheh, Y., Pramod, A. B., Ley, K. Macrophage polarization: different gene signatures in M1(LPS+) vs. classically and M2(LPS-) vs. alternatively activated macrophages. Frontiers in Immunology. 10, 1084 (2019).
