La imagen de calcio microendoscópica in vivo es una herramienta invaluable que permite el monitoreo en tiempo real de las actividades neuronales en animales que se comportan libremente. Sin embargo, aplicar esta técnica a la amígdala ha sido difícil. Este protocolo tiene como objetivo proporcionar una guía útil para atacar con éxito las células de amígdala con un microscopio miniaturizado en ratones.
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Artículo de método
Imágenes de calcio in vivo exitosas con un microscopio miniaturizado head-mount en la amígdala del ratón que se comporta libremente
En este artículo
Resumen
Resumen
El monitoreo in vivo en tiempo real de las actividades neuronales en animales en movimiento libre es uno de los enfoques clave para vincular la actividad neuronal con el comportamiento. Para ello, se ha desarrollado y aplicado con éxito a muchas estructuras cerebrales1,2,3,4,5,6una técnica de imágenes in vivo que detecta transitorios de calcio en las neuronas utilizando indicadores de calcio codificados genéticamente (GECIs), un microscopio de fluorescencia miniaturizado y una lente de índice refractivo degradado (GRIN). Esta técnica de imágenes es particularmente potente porque permite la toma de imágenes simultáneas crónicas de poblaciones celulares genéticamente definidas durante un período a largo plazo hasta varias semanas. Aunque útil, esta técnica de imagen no se ha aplicado fácilmente a las estructuras cerebrales que se encuentran en lo profundo del cerebro como la amígdala, una estructura cerebral esencial para el procesamiento emocional y la memoria del miedo asociativo7. Hay varios factores que dificultan la aplicación de la técnica de imagen a la amígdala. Por ejemplo, los artefactos de movimiento generalmente ocurren con más frecuencia durante las imágenes realizadas en las regiones cerebrales más profundas porque un microscopio de montaje en la cabeza implantado en las profundidades del cerebro es relativamente inestable. Otro problema es que el ventrículo lateral se coloca cerca de la lente GRIN implantada y su movimiento durante la respiración puede causar artefactos de movimiento altamente irregulares que no se pueden corregir fácilmente, lo que dificulta la formación de una vista de imagen estable. Además, debido a que las células de la amígdala suelen estar silenciosas en un estado de reposo o anestesiado, es difícil encontrar y enfocar las células objetivo que expresan GECI en la amígdala durante el procedimiento de placa base para obtener imágenes posteriores. Este protocolo proporciona una guía útil sobre cómo dirigirse eficientemente a las células que expresan GECI en la amígdala con microscopio miniaturizado de montaje en la cabeza para obtener imágenes de calcio in vivo exitosas en una región cerebral más profunda. Se observa que este protocolo se basa en un sistema particular (por ejemplo, Inscopix) pero no se limita a él.
Introducción
El calcio es un segundo mensajero omnipresente, jugando un papel crucial en casi todas las funciones celulares8. En las neuronas, el disparo potencial de acción y la entrada sináptica causan un cambio rápido de libre intracelular [Ca2+]9,10. Por lo tanto, el seguimiento de los transitorios de calcio proporciona una oportunidad para monitorear la actividad neuronal. Los GECIs son potentes herramientas que permiten monitorear [Ca2+] en poblaciones celulares definidas y compartimentos intracelulares11,12. Entr....
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Protocolo
Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité de Ética Animal del Instituto Avanzado de Ciencia y Tecnología de Corea. Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con las directrices del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales.
NOTA: Este protocolo consta de seis pasos principales: cirugía de inyección de virus, cirugía de implante de lente GRIN, validación de implantación de lente GRIN, accesorio de placa base, grabación óptica de señal GCaMP durante una prueba de comportamiento y procesamiento de datos(Figura 1A). A excepción de la cirugía, se utiliza el paquete de software comercial (....
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Resultados
Validación de la implantación de lentes GRIN
Antes de conectar crónicamente la placa base al cerebro mediante la cementación, la implantación de la lente GRIN debe ser validada. En animales con implantación exitosa de lentes, tanto las células que expresan GCaMP como los vasos sanguíneos se observaron claramente dentro de un rango de plano focal determinado por la distancia entre la lente objetiva del microscopio y la lente GRIN implantada(Figura 2
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Discusión
Las técnicas de cirugía hábiles son esenciales para lograr imágenes ópticas de calcio in vivo exitosas con microscopía en miniatura de montaje en la cabeza en regiones cerebrales más profundas como la amígdala como la describimos aquí. Por lo tanto, aunque este protocolo proporciona una guía para procesos quirúrgicos optimizados de fijación de placa base e implantación de lentes GRIN, es posible que sean necesarios procesos de optimización adicionales para pasos críticos. Como se menciona en la sección de protocolo, las .......
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Divulgaciones
El autor no tiene nada que revelar
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por subvenciones de Samsung Science and Technology Foundation (Número de proyecto SSTF-BA1801-10).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Aguja 26G | BD | 302002 | Cirugía |
| AAV1-Syn-GCaMP7b-WPRE | Addgene | 104493-AAV1 | Cirugía |
| AAV2/1-CaMKiiα-GFP | medida | ||
| Cemento Acrílico-Dental (Ortho-jet Acrílico Rosa) | Lang | 1334-rosa | Cirugía & Fijación de la placa base |
| Manipulador de flujo de aire | Neurotar | NTR000253-04 Fijación de | la placa base |
| Amoxicilina | SIGMA | A8523-5G | |
| Placa base | INSCOPIX | 1050-002192 | Fijación de la placa base |
| Cubierta de la placa base | INSCOPIX | 1050-002193 | Fijación de la placa base |
| Aparato de comportamiento (cámara) | Coulbourn Instrumento | Testcage | Prueba de comportamiento |
| Aparato de comportamiento (software) | Coulbourn Instrument | Freeze Frame | Prueba de comportamiento |
| Jaula de carbono | Neurotar | 180mm x 70mm | Placa base Accesorio |
| Carprofeno | SIGMA | PHR1452-1G | Cirugía |
| Software de procesamiento de datos | INSCOPIX INSCOPIX | Software de procesamiento de datos | Placa base Adjunto & Prueba de comportamiento |
| Dexametasona | SIGMA | D1756-500MG | |
| Taladro | Seyang | marathon-4 | Fresa de cirugía |
| ELA | US1/2, Shank104 | Cirugía | |
| Aguja de vidrio | WPI | PG10165-4 | |
| Cirugía Lente GRIN (INSCOPIX Proview Lens Probe) | INSCOPIX | 1050-002208 | Cirugía |
| Hamilton Jeringa | Hamilton | 84875 | Placa de cabeza de cirugía |
| Neurotar | Modelo 5 | Llave | |
| hexagonal de | INSCOPIX | 1050-004195 | Accesorio de placa |
| base Ordenador portátil | Samsung | NT950XBV | Surgery & Fijación de la placa base |
| Soporte de la lente, varilla estereotáxica (kit de implantes INSCOPIX proview) | INSCOPIX | 1050-004223 | Pinza |
| microscopio | INSCOPIX | 1050-002199 | fijación de la placa base |
| , software DAQ, hardware | INSCOPIX | nVista 3.0 | Fijación de la placa base & Prueba de comportamiento |
| Jaula para casa móvil | Neurotar | MHC V5 | Accesorio de placa base |
| Brazo motriz | Neurostar | Cirugía personalizada | Software |
| brazo moteado | Neurostar | Cirugía personalizada | |
| Tablero de NI | Instrumento | Prueba de comportamiento | |
| Unión epoxi extraíble | WPI | Kwik-Cast | Surgery |
| Cemento de resina (Super-bond) | Sun medical | Super bond C& B | Cirugía |
| Tornillo de cráneo | Stoelting | 51457 | Cirugía |
| Portaelectrodos estereotáxico | ASI | EH-600 | Cirugía |
| Marco estereotáxico | Stoelting | 51600 | Cirugía |
| Manipulador estereotámico | Stoelting | 51600 | Fijación de placa base |
Referencias
- Gonzalez, W. G., Zhang, H., Harutyunyan, A., Lois, C. Persistence of neuronal representations through time and damage in the hippocampus. Science. 365 (6455), 821-825 (2019).
- Ghandour, K., et al. Orchestrated ensemble activities constitute a hippocamp....
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Reimpresiones y permisos
