El método presentado implica el estiramiento uniaxial de hidrogeles blandos 3D incrustados en caucho de silicona mientras permite la microscopía confocal viva. Se demuestra la caracterización de las cepas de hidrogel externas e internas, así como la alineación de la fibra. El dispositivo y el protocolo desarrollados pueden evaluar la respuesta de las células a diversos regímenes de deformación.
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Artículo de método
Cepa controlada de hidrogeles 3D bajo imágenes de microscopía en vivo
En este artículo
Resumen
Resumen
Las fuerzas externas son un factor importante en la formación, el desarrollo y el mantenimiento de los tejidos. Los efectos de estas fuerzas se estudian a menudo utilizando métodos de estiramiento in vitro especializados. Varios sistemas disponibles utilizan camillas basadas en sustrato 2D, mientras que la accesibilidad de las técnicas 3D para tensar hidrogeles blandos, es más restringida. Aquí, describimos un método que permite el estiramiento externo de hidrogeles blandos de su circunferencia, utilizando una tira de silicona elástica como el portador de la muestra. El sistema de estiramiento utilizado en este protocolo está construido a partir de piezas impresas en 3D y electrónica de bajo costo, por lo que es simple y fácil de replicar en otros laboratorios. El proceso experimental comienza con hidrogeles de fibrina blanda polimerización (>100 μm) (módulo elástico de ~ 100 Pa) en un recorte en el centro de una tira de silicona. Las construcciones de gel de silicona se unen al dispositivo de estiramiento impreso y se colocan en la etapa de microscopio confocal. Bajo microscopía en vivo, se activa el dispositivo de estiramiento, y los geles se muestran en varias magnitudes de estiramiento. El procesamiento de imágenes se utiliza para cuantificar las deformaciones de gel resultantes, demostrando cepas relativamente homogéneas y alineación de fibras a lo largo del espesor 3D del gel (ejeZ). Las ventajas de este método incluyen la capacidad de colar hidrogeles extremadamente blandos en 3D mientras se ejecuta microscopía in situ, y la libertad de manipular la geometría y el tamaño de la muestra de acuerdo con las necesidades del usuario. Además, con la adaptación adecuada, este método se puede utilizar para estirar otros tipos de hidrogeles (por ejemplo, colágeno, poliacrilamida o polietilenglicol) y puede permitir el análisis de las células y la respuesta de los tejidos a las fuerzas externas en condiciones 3D más biomiméticas.
Introducción
La respuesta tisular a las fuerzas mecánicas es una parte integral de una amplia gama de funciones biológicas, incluyendo la expresióngénica 1,la diferenciación celular2,y la remodelación tisular3. Por otra parte, los cambios inducidos por la fuerza en la matriz extracelular (ECM) tales como alineación y densificación de la fibra pueden afectar comportamiento de la célula y la formación del tejido4,5,6. La estructura de malla fibrosa del ECM tiene propiedades mecánicas intrigantes, como elasticidad no lin....
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Protocolo
1. Preparación de la solución (que se realizará con antelación)
- Etiquetado de fibrinógeno
NOTA: El paso de etiquetado es necesario sólo si se desea analizar la deformación del gel de fibrina. Para experimentos celulares, es posible usar un gel sin etiquetar.- Añadir 38 μL de 10 mg/mL de colorante fluorescente de éster succinimidilo (disuelto en DMSO) a 1,5 mL de solución de fibrinógeno de 15 mg/mL (relación molar de 5:1) en un tubo de centrífuga de 50 mL y colocar en una coctelera durante 1 hora a temperatura ambiente. Después, coloque el tubo en la centrífuga durante 3 minutos a 800 x g (temperatura ambiente).
- Filtre el sobrena....
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Resultados
Los datos representativos del estiramiento estático de magnitudes crecientes aplicado a la tira de silicona portadora de un hidrogel de fibrina 3D, embebido con perlas fluorescentes de 1 μm, se muestran en la Figura 9. El análisis demuestra el efecto del estiramiento de silicona en los cambios geométricos del recorte, así como las cepas desarrolladas dentro del gel. Lasimágenes de pila Z de todo el gel se utilizan para evaluar la deformación del recorte original en forma de.......
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Discusión
El método y el protocolo presentados aquí se basan en gran medida en nuestro estudio anterior de Roitblat Riba et al.41 Incluimos aquí el diseño completo asistido por computadora (CAD), Python y los códigos de microcontrolador del dispositivo SCyUS.
Las principales ventajas del método presentado sobre los enfoques existentes incluyen la posibilidad de colar hidrogeles 3D muy suaves (módulo elástico de ~ 100 Pa) desde su circunferencia, y bajo imágenes confocale.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Algunas figuras incluidas aquí han sido adaptadas con permiso del Copyright Clearance Center: Springer Nature, Annals of Biomedical Engineering. Straining 3D hydrogels with uniform z-axis strains while enabling live microscopy imaging, A. Roitblat Riba, S. Natan, A. Kolel, H. Rushkin, O. Tchaicheeyan, A. Lesman, Copyright© (2019).
https://doi.org/10.1007/s10439-019-02426-7
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Alexa Fluor 546 ácido carboxílico, éster succinimidílico | Invitrogen | A20002 | |
| Medio celular (DMEM High Glucose) | Biological Industries | 01-052-1A | Agregue 10% FBS, 1% PNS, 1% L-glutamina, 1% Piruvato de sodio |
| Cubreobjetos #1.5 | Bar-Naor Ltd. | BN72204-30 | 22 veces; 40 mm |
| SULFÓXIDO DE DIMETILO 99.5% GC DMSO | Sigma-Aldrich Inc. | D-5879-500 ML | |
| Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco | Industrias Biológicas | 02-023-1A | |
| EVICEL Sellador de fibrina (humano) | Omrix Biopharmaceuticals | 3902 | Fibrinógeno: 70 mg/mL, Trombina: 800-1200 UI/mL |
| Tampón de fibrinógeno | N/A | Receta para 1L: 7 g de NaCl, 2,94 g de citrato trisódico dihidratado, 9 g de glicina, 20 g de clorhidrato de arginina y 0,15 g de cloruro de calcio dihidratado. Lleve el volumen final a 1L con PuW (pH 7.0-7.2) | |
| Microperlas fluorescentes FluoSpheres (1 µ m) | Invitrogen | F8820 | Naranja (540/560) Suministrado como suspensión (2% de sólidos) en agua más 2 mM de azida sódica |
| Caucho de silicona de alta temperatura | McMaster-Carr | 3788T41 | 580 µ m-espesor E = 1,5 Mpa Relación de Poisson = 0,48 Resistencia a la tracción = 4,8 MPa Límite superior de estiramiento = +300% de tensión de ingeniería |
| Columna de desalinización HiTrap 5 mL (Empaquetado Sephadex G-25) | GE Healthcare | 17-1408-01 | |
| Compuesto de sellado de alto vacío HIVAC-G | Shin-Etsu Chemical Co., Ltd. | HIVAC-G 100 | |
| ImageJ FIJI software39 | National Institute of Health, Bethesda, MD | Versión 1.8.0_112 | |
| Microcontrolador (Adruino Uno + Adafruit Motorshield v2.3)Arduino | /Adafruit | Arduino-DK001/Adafruit-1438 | |
| MicroVL 21R Centrífuga | Thermo Scientific | 75002470 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| Microscopio óptico Primovert | Carl Zeiss Suzhou Co., Ltd. | 491206-0011-000 | |
| SCyUS CAD (Solidworks) | Dassault Systè mes | N/A | |
| SCyUS Código37 | N/A | N/A | |
| Servomotor - TowerPro SG-5010 | Centrífuga Adafruit | 155 | |
| SL 16R | Thermo Scientific | 75004030 | para tubos de 50 mL |
| Placas estériles de 10 cm | |||
| Corning | N/A | Receta para 1L: 20 g de manitol, 8,77 g de NaCl, 2,72 g de acetato de sodio trihidrato, 24 mL de albúmina sérica humana al 25%, 5,88 g de cloruro de calcio. Lleve el volumen final a 1 L con PuW (pH 7.0) | |
| Tripsina EDTA Solución B (0.25%), EDTA (0.05%) | Biological Industries | 03-052-1B | |
| Cable USB (Tipo B Macho a Tipo A Macho) | N/A | N/A | |
| Microscopio Confocal Zeiss LSM 880 | Carl Zeiss AG | 2811000417 | |
| ZEN 2.3 SP1 FP3 (negro) | Carl Zeiss AG | Versión de lanzamiento 14.0.0.0 |
Referencias
- Bleuel, J., Zaucke, V., Bruggemann, G. P., Niehoff, A. Effects of cyclic tensile strain on chondrocyte metabolism: a systematic review. PLoS ONE. 10, 0119816(2015).
- Pennisi, C. P., Olesen, C. G., de Zee, M., Rasmussen, J., Zachar, V. Uniaxial cycli....
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Reimpresiones y permisos
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