Se describe una metodología para la determinación de los requisitos de polinización en híbridos japoneses de tipo ciruela, que combina polinizaciones de campo y laboratorio y observaciones de tubos de polen bajo la microscopía de fluorescencia con la identificación de genotipos Spor PCR y el monitoreo de la floración para la selección de polinizadores.
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Artículo de método
Establecimiento de requisitos de polinización en la ciruela japonesa mediante monitoreo fenológico, polinizaciones manuales, microscopía de fluorescencia y genotipado molecular
En este artículo
Resumen
Resumen
Los cultivares de ciruela japonesa comúnmente cultivados son híbridos interespecíficos derivados de cruces entre el Prunus salicina original con otras especies de Prunus. La mayoría de los híbridos exhiben autoincompatibilidad gametofítica, que está controlada por un locus Súnico y altamente polimórfico que contiene múltiples alelos. La mayoría de los híbridos cultivados son autoincompatibles y necesitan polen de un donante compatible para fertilizar sus flores. El establecimiento de requisitos de polinización en la ciruela japonesa es cada vez más importante debido al alto número de nuevos cultivares con requisitos de polinización desconocidos. En este trabajo, se describe una metodología para la determinación de los requisitos de polinización en híbridos japoneses de tipo ciruela. La autocompatibilidad se determina mediante polinizaciones manuales tanto en el campo como en el laboratorio, seguidas de un monitoreo del alargamiento del tubo polínico con microscopía de fluorescencia y también un monitoreo de la maduración de la fruta en el campo. La selección de cultivares polinizadores se evalúa combinando la identificación de genotipos Smediante análisis PCR con el seguimiento del tiempo de floración en campo. Conocer los requerimientos de polinización de los cultivares facilita la selección de cultivares para el diseño de nuevos huertos y permite la detección temprana de problemas de productividad relacionados con la deficiencia de polinización en huertos establecidos.
Introducción
La ciruela japonesa(Prunus salicina Lindl.) es originaria de China1. En elsiglo 19, este cultivo se introdujo desde Japón a los Estados Unidos, donde se cruzó con otras ciruelas diploides de América del Norte2. En elsiglo 20, algunos de estos híbridos se extendieron a regiones templadas de todo el mundo. Hoy en día, el término "ciruela japonesa" se refiere a una amplia gama de híbridos interespecíficos derivados de cruces entre el original P. salicina con hasta otros 15 Prunus diploides spp.3,4,
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Protocolo
1. Polinización manual en el campo
-
Extracción de polen
- Para obtener polen, recolectar capullos florales en la etapa D24,de acuerdo con la etapa 57 en la escala BBCH25,26.
NOTA: Se necesitan más capullos florales en la ciruela japonesa que en otras especies de Prunus porque sus anteras producen menos polen. - Retire las anteras con una malla de plástico (tamaño de poro de 2 mm x 2 mm) y colóquelas en papel a temperatura ambiente durante 24 h hasta la dehiscencia de la antera.
- Tamizar los granos de polen a través de una....
- Para obtener polen, recolectar capullos florales en la etapa D24,de acuerdo con la etapa 57 en la escala BBCH25,26.
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Resultados
Cada capullo de flor de ciruelo japonés contiene una inflorescencia con 1-3 flores. Al igual que en otras especies de frutas de hueso, cada flor se compone de cuatro verticilos: carpelo, estambres, pétalos y sépalos, que se fusionan formando una copa en la base de la flor. Las estructuras florales son más pequeñas que otras frutas de hueso, con un pistilo corto y frágil rodeado por los estambres que contienen una pequeña cantidad de granos de polen. En plena floración, las flores de cada inflorescencia aparecen separadas.......
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Discusión
La metodología descrita en este documento para los requisitos de polinización de los cultivares de ciruela japonesa requiere determinar la auto(in)compatibilidad de cada cultivar mediante polinizaciones controladas en el campo o el laboratorio, y la posterior observación del crecimiento del tubo de polen con microscopía de fluorescencia. Las relaciones de incompatibilidad se establecen mediante la caracterización de los alelos Smediante genotipado molecular. Por último, la selección de polinizadores se realiza m.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Esta investigación fue financiada por el Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (RFP2015-00015-00 y RTA2017-00003-00); Gobierno de Aragón—Fondo Social Europeo, Unión Europea (Grupo Consolidado A12-17R), y Junta de Extremadura —Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER), Plan Regional de Investigación (IB16181), Grupo de Investigación (AGA001, GR18196). B.I. Guerrero fue apoyado por una beca del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología de México (CONACYT, 471839).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Ácido Acético Glacial | Panreac | 131008.1611 | |
| Agar | iNtRON Biotechnology | 25999 | |
| Azul de anilina | Difco | 8504-88 | |
| Ácido bórico (H3BO4) | Panreac | 131015.1210 | |
| Nitrato de calcio 4-hidrato (Ca(NO3)2 &punto medio; 4H2O) | Panreac | 131231.1211 | |
| Cubreobjetos | Deltalab | D102460 | 24 mm x 60 mm |
| Digital Camera | Imaging Developmet Systems | UI-1490SE | |
| Digital Camera Software Suite | Imaging Developmet Systems | 4.93.0. | |
| ADN Oligos | ThermoFisher Scientific | ||
| dNTP Mix, 10 mM cada uno | ThermoSischer Scientific | R0193 | |
| DreamTaq ADN polimerasa | verde ThermoFisher Scientific | EP0713 | |
| Etanol 96&grados; | VWR-Chemicals | 83804.360 | |
| 1Kb Escalera de ADN (Patente de EE. UU. No. 4.403.036) (500pb-12Kb) | Invitrogen | 15615-016 | Tamaño: 250µ g; Conc: 1.0 y micro; g/µ l |
| Sistema de documentación de gel | Bio-Rad | 1708195 | |
| Contador de mano | Tamaco | TM-4 | |
| Software de laboratorio de imágenes | Bio-Rad | Sistema de análisis de imágenes para gel Sistema de documentación | |
| MetaPhor Agarose | Lonza | 50180 | |
| Microcentrífuga 5415 R | Eppendorf | Z605212 | |
| Microscopio con UV eflurescencia | Leica | DM2500 | Filtro excitador BP340-390, Filtro de barrera LP425 |
| Microportaobjetos | Deltalab | D100004 | 26 mm x 76 mm |
| Mini Sistema de electroforesis | Fisherbrand | 14955170 | |
| Minicentrífuga | ThermoFisher Scientific | 15334204 | |
| NanoDrop 1000 Espectrofotómetro | ThermoFisher Scientific | ND1000 | |
| Placas de Petri | Deltalab 200201 | 55 mm x 14 mm | |
| Fosfato de Potasio Tribásico (K3PO4· 1.5H2O) | Panreac | 141513 | |
| Primer forward 'Pru C2'ThermoFisher | Scientific | ||
| Primer forward Pru T2'ThermoFisher | Scientific | ||
| Primer reverse 'PCER'ThermoFisher | Scientific | ||
| RedSafe Solución de tinción de ácidos nucleicos | iNtRON Biotechnology | 21141 | |
| Sacarosa | Panreac | 131621.1211 | |
| Sulfito de sodio anhidro (Na2SO3) | Panreac | 131717.1211 | |
| Speedtools kit de extracción de ADN vegetal | Biotools | 21272 | |
| TBE Buffer (10X) | Panreac | A0972,5000PE | |
| Termociclador T100 | Bio-Rad | ||
| Termomezclador confort | Eppendorf | T1317 | |
| Autoclave vertical Presoclave II | JP Selecta | 4001725 | |
| Vortex | Fisherbrand | 11746744 |
Referencias
- Hendrick, U. P. The Plums of New York. , J. B. Lyon Co., State Printers. (1911).
- Okie, W. R., Hancock, J. F. Plums. Temperate Fruit Crop Breeding. Hancock, J. F. , Springer. Dordrecht. 337-357 (2008).
- Guerra, M. E., Rodrigo, J.
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Reimpresiones y permisos
