Un cultivo de explantes de cola 3-D para estudiar la segmentación de vertebrados en el pez cebra

Summary

Aquí, presentamos el protocolo para el cultivo de tejidos 3-D del eje posterior del cuerpo del pez cebra, lo que permite el estudio en vivo de la segmentación de vertebrados. Este modelo de explant proporciona control sobre el alargamiento del eje, alteración de las fuentes de morfógenos y obtención de imágenes vivas a nivel de tejido de resolución subcelular.

Abstract

Los embriones de vertebrados modelan su eje corporal principal como somitas repetitivas, los precursores de las vértebras, los músculos y la piel. Las somitas se segmentan progresivamente desde el mesodermo presomático (PSM) a medida que el extremo de la cola del embrión se alarga posteriormente. Los somitas se forman con periodicidad regular y escala en tamaño. El pez cebra es un organismo modelo popular, ya que es genéticamente manejable y tiene embriones transparentes que permiten obtener imágenes vivas. Sin embargo, durante la somitogénesis, los embriones de peces se envuelven alrededor de una yema grande y redondeada. Esta geometría limita las imágenes vivas de tejido PSM en embriones de pez cebra, particularmente a resoluciones más altas que requieren una distancia de trabajo objetiva cercana. Aquí, presentamos un método aplanado de la cultura del tejido de 3-D para la proyección de imagen viva de los explantes de la cola del pez cebra. Los explantes de cola imitan los embriones intactos mostrando una desaceleración proporcional de la elongación del eje y el acortamiento de las longitudes de somita rostrocaudal. Además, somos capaces de detener la velocidad de elongación del eje a través del cultivo de explantes. Esto, por primera vez, nos permite desenredar la entrada química de los gradientes de señalización de la entrada mecanicista de la elongación axial. En estudios futuros, este método se puede combinar con una configuración microfluídica para permitir perturbaciones farmacéuticas controladas por el tiempo o la detección de la segmentación de vertebrados sin ningún problema de penetración de fármacos.

Introduction

La segmentación metamérica de organismos es ampliamente utilizada en la naturaleza. Las estructuras repetidas son esenciales para la funcionalidad de órganos laterales como vértebras, músculos, nervios, vasos, extremidades u hojas en un plan corporal^1. Como resultado de tales restricciones fisiológicas y geométricas de la simetría axial, la mayoría de los filos de Bilateria-tales como anélidos, artrópodos, y cordados-exhiben la segmentación de sus tejidos embrionarios (e.g., ectodermo, mesodermo) antero-posteriorly.

Los embriones de vertebrados segmentan secuencialmente su mesodermo paraxial a lo largo del eje princi....

Protocol

Este protocolo implica el uso de embriones de vertebrados vivos menores de 1 día después de la fertilización. Todos los experimentos con animales se realizaron bajo las pautas éticas del Cincinnati Children's Hospital Medical Center; los protocolos de animales fueron revisados y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (Protocolo # 2017-0048).

1. Recolección de embriones

1. Configure pares de peces cebra en tanques de cruce la noche antes del día de recolección de embriones. Para un control preciso de la estadificación del desarrollo embrionario, utilice barreras entre las parejas de apareamiento.
2. ....

Results

Este protocolo permite el cultivo geométrico plano de explantes de cola de pez cebra vivos. El cultivo de tejidos presenta tres ventajas principales sobre embriones enteros: 1) control de la velocidad de elongación del eje, 2) control sobre varias fuentes de señalización (morfógeno) por disección simple, y 3) cerca de objetivos, alta ampliación y altas imágenes en vivo de NA.

Las cámaras deslizantes no tratadas químicamente permiten que el explante de la cola alargue su eje principal

Discussion

Este artículo presenta un protocolo detallado de una técnica del explant de la cultura del tejido que desarrollamos y utilizamos recientemente⁵ para los embriones del pez cebra. Nuestra técnica se basa en los métodos de explantación anteriores en el polluelo⁸ y el pez cebra^9,10,11 organismos modelo. Los explantes de cola preparados con este protocolo pueden sobrevivir hasta >12 h e.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Jeringa Sub-Q de 1 mL con aguja PrecisionGlide	Becton, Dickinson and Co.	REF 309597	para la descorionación de embriones y manipulaciones
Etanol de 200 pruebas, anhidro	Decon Labs	2701	para inmunotinción
Solución antibiótica antimicótica (100×)	Sigma-Aldrich	A5955	para medios de disección
de tejidos Cloruro de calcio anhidro, en polvo	Sigma-Aldrich	499609	para medios
de disección de tejidos Dimetilsulfóxido Sigma-Aldrich		D5879	para inmunotinción
Bisturí desechable, #10 Acero inoxidable	Integra-Miltex	MIL4-411	para la preparación de pocillos de cinta
adhesiva 3-aminobenzoato de etilo sal de metanosulfonato (Tricaína)	Sigma-Aldrich	886-86-2	(opcional) para anestesiar tejidos de más de 20 años de edad en etapa de somitas
Suero fetal bovino (FBS)	ThermoFisher	A3160601	adicional para medios de cultivo
de tejidos Cabra anti-ratón IgG2b, Alexa Fluor 594	Invitrogen	Cat#A-21145; RRID: AB_2535781	anticuerpo secundario para la inmunotinción
Medio L-15 con L-glutamina sin rojo de fenol	GIBCO	21083-027	para medios de disección de tejidos
Metanol	Sigma-Aldrich	179337	para inmunotinción
Bisturí córneal microquirúrgico 2,85 mm Punta en ángulo Hoja de doble bisel	Especialidades quirúrgicas	72-2863	para disección de tejidos
Monoclonal de ratón anti-ppERK	Sigma-Aldrich	Cat#M8159; RRID:AB_477245	para inmunotinción ppERK
NucRed Live 647 ReadyProbes Reactivo	Invitrogen	R37106	(opcional) para la tinción en vivo de núcleos celulares
Polvo de paraformaldehído, 95%	Sigma-Aldrich	158127	para la fijación de muestras para inmunotinción Solución de recubrimiento de colágeno de
cola de rata	Sigma-Aldrich	122-20	(opcional) para la activación química de cámaras de portaobjetos
Incubadora Stage Top Tokai	Hit	tokai-hit-stxg	(opcional) para el control de la temperatura durante la obtención de imágenes en vivo
Cinta transparente 3/4''	Scotch	S-9782	para la preparación de pocillos portaobjetos de cinta
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100	para inmunotinción
Tween 20	Sigma-Aldrich	P1379	para inmunotinción
Pez cebra: Tg( actb2:2xMCP-NLS-EGFP)Campbell	et al., 2015	ZFIN: ZDB-TGCONSTRCT-150624-4	peces transgénicos con EGFP localizado nuclear
Pez cebra: Tg(Ola.Actb:Hsa.HRAS-EGFP)	Cooper et al., 2005	ZFIN: ZDB-TGCONSTRCT-070117-75	peces transgénicos con EGFP localizado en la membrana celular