Un modelo de endotoxina reproducible orientado a la unidad de cuidados intensivos en ratas
Summary
Aquí, presentamos un modelo de endotoxina reproducible orientado a la unidad de cuidados intensivos en ratas.
Abstract
La sepsis y el shock séptico siguen siendo la principal causa de muerte en las unidades de cuidados intensivos. A pesar de las mejoras significativas en el manejo de la sepsis, la mortalidad todavía oscila entre el 20 y el 30%. Se necesitan urgentemente nuevos enfoques de tratamiento para reducir la insuficiencia multiorgánica relacionada con la sepsis y la muerte. Los modelos animales robustos permiten uno o múltiples enfoques de tratamiento, así como probar su efecto sobre los parámetros fisiológicos y moleculares. En este artículo, se presenta un modelo animal simple.
En primer lugar, la anestesia general se induce en animales, ya sea con el uso de anestesia volátil o intraperitoneal. Después de la colocación de un catéter intravenoso (vena de la cola), la traqueostomía y la inserción de un catéter intraarterial (arteria de la cola), se inicia la ventilación mecánica. Se registran los valores basales de la presión arterial media, la saturación de oxígeno en sangre arterial y la frecuencia cardíaca.
La inyección de lipopolisacáridos (1 miligramo/kilogramo de peso corporal) disueltos en solución salina tamponada con fosfato induce una respuesta inflamatoria fuerte y reproducible a través del receptor tipo toll 4. Las correcciones de líquidos, así como la aplicación de norepinefrina se realizan en base a protocolos bien establecidos.
El modelo animal presentado en este artículo es fácil de aprender y está fuertemente orientado hacia el tratamiento clínico de la sepsis en una unidad de cuidados intensivos con sedación, ventilación mecánica, monitoreo continuo de la presión arterial y muestreo de sangre repetitivo. Además, el modelo es confiable, lo que permite datos reproducibles con un número limitado de animales de acuerdo con los principios 3R (reducir, reemplazar, refinar) de la investigación con animales. Si bien los experimentos con animales en la investigación de la sepsis no se pueden reemplazar fácilmente, las mediciones repetitivas permiten una reducción de los animales y mantener a los animales sépticos anestesiados disminuye el sufrimiento.
Introduction
La sepsis y su forma más grave, el shock séptico, son síndromes en el terreno de una infección, lo que resulta en una reacción inflamatoria excesiva con la liberación de citoquinas, lo que lleva a cambios fisiológicos y bioquímicos con una defensa inmune suprimida y resultados fatales 1,2. Esta reacción inflamatoria desequilibrada resulta en disfunción orgánica e insuficiencia orgánica en varios órganos vitales como el pulmón, el riñón y el hígado. Con un 37%3, la sepsis es una de las razones más comunes para que un paciente sea ingresado en una unidad de cuidados intensivos (UCI). La mortalidad por sepsis oscila actualmente en torno al 20-30%4. El tratamiento antibiótico temprano y eficaz es de suma importancia5. La reanimación con líquidos y vasopresores debe instalarse temprano, aparte de eso, el tratamiento es puramente de apoyo6.
La sepsis se define como una infección comprobada o sospechada con bacterias, hongos, virus o parásitos, que se acompaña de disfunción orgánica. Los criterios de shock séptico se cumplen cuando un colapso cardiovascular adicional no responde solo al tratamiento con líquidos, y un nivel de lactato de más de 2 milimoles / litro está presente2. La insuficiencia orgánica relacionada con la sepsis puede ocurrir en cualquier órgano, pero es muy común en el sistema cardiovascular, el cerebro, el riñón, el hígado y el pulmón. La mayoría de los pacientes que sufren de sepsis requieren intubación endotraqueal para asegurar las vías respiratorias del paciente, para protegerse de la aspiración y para aplicar ventilación espiratoria final positiva con una alta fracción de oxígeno inspirado para prevenir o superar la hipoxia. Para tolerar un tubo traqueal y ventilación mecánica, los pacientes generalmente requieren sedación.
Las endotoxinas, como los lipopolisacáridos (LPS) como componente de la membrana de las bacterias gramnegativas inducen una fuerte reacción inflamatoria a través del receptor tipo toll (TLR) 47. La activación de una vía definida asegura una reacción inflamatoria estable. Las citoquinas como la proteína quimioatrayente de neutrófilos inducida por citoquinas 1 (CINC-1), la proteína quimioatrayente de monocitos 1 (MCP-1) y la interleucina 6 (IL-6) se conocen como factores pronósticos de gravedad y resultado en este modelo8. La aplicación intravenosa de LPS se ha utilizado con éxito para estudiar diversos aspectos de la sepsis en ratas 8,9.
El tratamiento de la sepsis sigue siendo un desafío, particularmente debido a la falta de modelos animales predictivos. Si la endotoxemia con activación de la inflamación sistémica es un modelo adecuado para el desarrollo de terapias farmacológicas es discutible. Sin embargo, con la conocida vía TLR 4 inducida por LPS se puede obtener un conocimiento importante.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo descrito aquí permite un modelo de sepsis altamente reproducible, pero fácil de aprender, que se puede adaptar de acuerdo con la pregunta de investigación. Los datos esenciales in vivo que se refieren a la función de los órganos, como la frecuencia cardíaca, la presión arterial y la saturación de oxígeno arterial periférica, se pueden recopilar continuamente, y el muestreo de sangre se puede realizar repetidamente a lo largo del experimento. Además, se pueden instalar modificaciones con respecto a…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer a Beatrice Beck-Schimmer (MD) y Erik Schadde (MD) por su examen crítico y su valiosa contribución para este manuscrito.
Materials
| 2-0 silk sutures | Ethicon, Sommerville, NJ | K833 | Standard surgical |
| 26 intravenous catheter | Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ | 391349 | Standard anesthesia equipment |
| 6-0 LOOK black braided silk | Surgical Specalities Corporation, Wyomissing, PA | SP114 | Standard surgical |
| Alaris Syringe Pump | Bencton Dickinson | ||
| Betadine | Mundipharma, Basel, Switzerland | 7.68034E+12 | GTIN-number |
| Curved fine tips microforceps | World precision instruments (WPI), Sarasota, FL | 504513 | Facilitates vascular preparation |
| Fine tips microforceps | World precision instruments (WPI), Sarasota, FL | 501976 | Tips need to be polished regularly |
| Infinity Delta XL Anesthesia monitoring | Draeger, Lübeck, Germany | ||
| Isoflurane, 250 mL bottles | Attane, Piramal, Mumbai, India | LDNI 22098 | Standard vet. equipment |
| Ketamine (Ketalar) | Pfitzer, New York, NY | ||
| Lipopolysaccharide (LPS) from Escherichia coli, serotype 055:B5 | Sigma, Buchs, Switzerland | ||
| Q-tips small | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany | EH11.1 | Standard surgical |
| Ringerfundin | Bbraun, Melsungen, Germany | ||
| Tec-3 Isofluorane Vaporizer | Ohmeda, GE-Healthcare, Chicago, IL | not available anymore | Standard vet. equipment |
| Xylazine (Xylazin Streuli) | Streuli AG, Uznach, Switzerland |
Referencias
- Hotchkiss, R. S., Karl, I. E. The pathophysiology and treatment of sepsis. New England Journal of Medicine. 348 (2), 138-150 (2003).
- Singer, M., et al. The Third International Consensus Definitions for Sepsis and Septic Shock (Sepsis-3). Journal of the American Medical Association. 315 (8), 801-810 (2016).
- Vincent, J. L., et al. Assessment of the worldwide burden of critical illness: the intensive care over nations (ICON) audit. Lancet Respiratory Medicine. 2 (5), 380-386 (2014).
- Fleischmann, C., et al. Assessment of Global Incidence and Mortality of Hospital-treated Sepsis. Current Estimates and Limitations. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 193 (3), 259-272 (2016).
- Kumar, A., et al. Duration of hypotension before initiation of effective antimicrobial therapy is the critical determinant of survival in human septic shock. Critical Care Medicine. 34 (6), 1589-1596 (2006).
- Gotts, J. E., Matthay, M. A. Sepsis: pathophysiology and clinical management. British Medical Journal. 353, (2016).
- Akira, S., Takeda, K. Toll-like receptor signalling. Nature Reviews Immunology. 4 (7), 499-511 (2004).
- Urner, M., et al. Insight into the beneficial immunomodulatory mechanism of the sevoflurane metabolite hexafluoro-2-propanol in a rat model of endotoxaemia. Clinical and Experimental Immunology. 181 (3), 468-479 (2015).
- Beck-Schimmer, B., et al. Which Anesthesia Regimen Is Best to Reduce Morbidity and Mortality in Lung Surgery?: A Multicenter Randomized Controlled Trial. Anesthesiology. 125 (2), 313-321 (2016).
- Deitch, E. A. Animal models of sepsis and shock: a review and lessons learned. Shock. 9 (1), 1-11 (1998).
- Buras, J. A., Holzmann, B., Sitkovsky, M. Animal models of sepsis: setting the stage. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (10), 854-865 (2005).
- Perretti, M., Duncan, G. S., Flower, R. J., Peers, S. H. Serum corticosterone, interleukin-1 and tumour necrosis factor in rat experimental endotoxaemia: comparison between Lewis and Wistar strains. British Journal of Pharmacology. 110 (2), 868-874 (1993).
- Marechal, X., et al. Endothelial glycocalyx damage during endotoxemia coincides with microcirculatory dysfunction and vascular oxidative stress. Shock. 29 (5), 572-576 (2008).
- Thiemermann, C., Ruetten, H., Wu, C. C., Vane, J. R. The multiple organ dysfunction syndrome caused by endotoxin in the rat: attenuation of liver dysfunction by inhibitors of nitric oxide synthase. British Journal of Pharmacology. 116 (7), 2845-2851 (1995).
- Osuchowski, M. F., et al. Minimum quality threshold in pre-clinical sepsis studies (MQTiPSS): an international expert consensus initiative for improvement of animal modeling in sepsis. Intensive Care Medicine Experimental. 6 (1), 26 (2018).
- Fink, M. P., Heard, S. O. Laboratory models of sepsis and septic shock. Journal of Surgical Research. 49 (2), 186-196 (1990).
- Buras, J. A., Holzmann, B., Sitkovsky, M. Animal models of sepsis: Setting the stage. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (10), 854-865 (2005).
- Balls, M. The principles of humane experimental technique: timeless insights and unheeded warnings. Altex-Alternatives to Animal Experimentation. 27 (2), 144-148 (2010).
