Presentamos protocolos para tres métodos diferentes para la homogeneización de cuatro grupos musculares diferentes de tejido muscular esquelético de rata para medir y comparar los niveles de nitrato y nitrito. Además, comparamos diferentes pesos de muestra para investigar si el tamaño de la muestra de tejido afecta los resultados de la homogeneización.
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Artículo de método
Preparación de homogeneizados del músculo esquelético de rata para mediciones de nitratos y nitritos
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Resumen
Resumen
Alguna vez se pensó que los iones de nitrato (NO3-) eran productos finales inertes del metabolismo del óxido nítrico (NO). Sin embargo, estudios previos demostraron que los iones de nitrato pueden convertirse de nuevo en NO en mamíferos a través de un mecanismo de reducción de dos pasos: el nitrato se reduce a nitrito (NO2-) principalmente por bacterias comensales orales, luego el nitrito se reduce a NO por varios mecanismos, incluso a través de proteínas que contienen hemo o molibdeno. Esta vía reductora del nitrato contribuye a mejorar las vías de señalización mediadas por NO, particularmente en el sistema cardiovascular y durante el ejercicio muscular. Los niveles de nitrato en el cuerpo antes de tal utilización están determinados por dos fuentes diferentes: oxidación endógena de NO y la ingesta de nitrato en la dieta, principalmente de plantas. Para dilucidar el ciclo complejo de NO en circunstancias fisiológicas, hemos examinado más a fondo la dinámica de sus metabolitos, iones de nitrato y nitrito, que son relativamente estables en comparación con NO. En estudios previos se identificó el músculo esquelético como un importante órgano de almacenamiento de iones de nitrato en mamíferos, así como una fuente directa de NO durante el ejercicio. Por lo tanto, establecer una metodología confiable para medir los niveles de nitrato y nitrito en el músculo esquelético es importante y debería ser útil para extender su aplicación a otras muestras de tejido. Este artículo explica en detalle la preparación de muestras de músculo esquelético, utilizando tres métodos de homogeneización diferentes, para mediciones de nitratos y nitritos y discute cuestiones importantes relacionadas con los procesos de homogeneización, incluido el tamaño de las muestras. Las concentraciones de nitrato y nitrito también se han comparado en cuatro grupos musculares diferentes.
Introducción
El óxido nítrico (NO), una pequeña molécula de señalización gaseosa, desempeña un papel crítico en los procesos fisiológicos y fisiopatológicos1. El NO puede ser producido a partir de L-arginina por enzimas endógenas de la familia de la óxido nítrico sintasa (NOS) antes de someterse a una rápida oxidación a nitrato (NO 3-) y, posiblemente, nitrito (NO2-) en sangre y tejidos 2,3. Recientemente, se ha demostrado que estos aniones se reducen de nuevo a NO en los sistemas de mamíferos4. El nitrato se convierte en nitrito, p....
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Protocolo
El protocolo animal fue aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales del NIDDK (ASP K049-MMB-20). Los animales fueron manejados y tratados de acuerdo con la Guía actual para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio disponible gratuitamente en el sitio web de AAALAC.
1. Colección de músculo esquelético de rata
- Mientras una rata está bajo anestesia profunda (isoflurano al 5%, confirmado por la ausencia de reacción al pellizco de la cola / pierna), comience la perfusión con solución salina que contenga heparina colocando una aguja de 19 G en un ápice del ventrículo izquierdo y haciendo un corte en la aurícula derecha. Permi....
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Resultados
Para obtener resultados representativos, se utilizaron tejidos del músculo esquelético de 8 ratas Wistar (machos y hembras, peso 250 ± 50 g). Los homogeneizados del músculo esquelético de rata (50 mg de músculo glúteo mayor para cada método) se prepararon mediante tres herramientas de homogeneización diferentes (homogeneizador rotativo, homogeneizador de perlas y pulverizador). Los contenidos de nitrato y nitrito de estos homogeneizados se determinaron utilizando un analizador de óxido nítrico (NOA) (
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Discusión
Para monitorear los cambios en los metabolitos de NO, nitrato y nitrito, en función de las intervenciones fisiológicas, es imperativo medir los niveles de estos iones en los diferentes órganos que son críticos en su metabolismo. Como la hemoglobina en la sangre reaccionará con el NO y sus metabolitos, también es importante eliminar la sangre rápidamente de las muestras de tejido tanto como sea posible. Por lo tanto, los animales fueron perfundidos con solución salina antes de recolectar tejidos del músculo esquelético (g.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses. Alan N. Schechter figura como coinventor en varias patentes emitidas a los Institutos Nacionales de Salud para el uso de sales de nitrito para el tratamiento de enfermedades cardiovasculares. Recibe regalías basadas en la licencia de los NIH de estas patentes para el desarrollo clínico, pero ninguna otra compensación. Estos arreglos no afectan su adhesión a las políticas de la revista JoVE.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por la subvención intramuros de NIH / NIDDK ZIA DK 0251041-14 a Alan N Schechter, MD.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| gentleMACS disociador | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| gentle MACS M tubo | Miltenyi Biotec | 130-093-236 | Longitud: 87 mm; Diámetro: 30 mm |
| Heparina Sódica | Hospira | NDC-0409-7620-13 | |
| Isoflurano | Baxter | NDC-10019-360-60 | |
| Metanol | Sigma | 646377 | |
| Minilys homogeneizador de perlas | Bertin Instruments | P000673-MLYS0-A | |
| NEM; N-etilmaleimida | Sigma | 4260 | |
| Analizador de óxido nítrico | GE | Sievers NOA 280i | |
| NP-40; 4-nonilfenilpolietilenglicol | Sigma | 74385 | |
| Ferricianuro de potasio; K3Fe(CN)6 | Sigma | 702587 | |
| Precellys kit de lisado | Bertin Instruments | P000911-LYSK0-A | contiene tubos de 2 mL con perlas cerámicas (óxido de circonio) de 2,8 mm para la homogeneización |
| Kit pulverizador | Trituradora de células | Kit |
Referencias
- Ignarro, L. J. Nitric oxide as a unique signaling molecule in the vascular system: a historical overview. Journal of Physiology and Pharmacology. 53 (4), Pt 1 503-514 (2002).
- Moncada, S., Higgs, A. The L-arginine-nitric oxide pathway. New....
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Reimpresiones y permisos
